Faktory vazba na pro-COL1A2 proximální promotor
Několik funkčních cis-působící prvky byly zjištěny v přibližně 400-bp proximální promotor myši pro-gen Col1a2 (154-2350 bp) a lidských minimální sekvence mezi 152 a 2378 bp. První transkripční faktor zjištěno, že se váží na tento promotor byl všudypřítomný CCAAT-vazba proteinů CBF. Tento transkripční faktor je tvořen ze tří samostatných podjednotek, pojmenované A, B, a C, které byly klonovány a sekvenovány (Maity a de Crombrugghe, 1998). Všechny tři podjednotky jsou potřebné pro CBF vázat se na sekvence obsahující CCAAT box se nachází mezi 280 a 284 a aktivovat transkripci, jak v lidské a myší geny (viz Obr. 13.2 B). Data In vitro naznačují, že podjednotky A A C se nejprve spojují a tvoří komplex A–C a že tento komplex pak tvoří heteromerní molekulu s podjednotkou B (Sinha et al ., 1995). Mutace v CCAAT box, které zabraňují vazbě CBF snížení transkripční aktivity pro-Col1a2 proximální promotor tři až pět krát v přechodné transfekci experimenty fibroblastický buněčných linií (Coustry et al., 1995). Čištěný CBF a CBF složený ze tří rekombinantních podjednotek také aktivují promotor pro-Col1a2 v jaderných extraktech bez buněk, které byly dříve vyčerpány CBF (Coustry et al., 1995). Dvě ze tří podjednotek CBF obsahují transkripční aktivační domény. Více nedávno, jeden substituce T A in vivo v přítomnosti nadřazeného enhancer lidské sekvence navrhl, že CBF je zapojen v šablonování kolagen typu I výraz v dorsoventral stejně jako rostrocaudal osy myši kožní fibroblasty (Tanaka et al., 2004).
kromě vazebné místo pro CBF, stopu experimenty a gel-shift studie identifikovány další vazebná místa v prvních 350 bp myši pro-Col1a2 pořadatel. Tři GC bohaté sekvence, která se nachází na asi 2160 bp (mezi 2176 a 2152 bp) a 2120 bp (mezi 2131 a 2114 bp) bylo prokázáno, že k interakci s DNA-vazebné proteiny footprint experimenty a gel-shift testy (Hasegawa et al., 1996). Odstranění v myši pořadatel zahrnující tyto tři footprinted sekvence zcela zrušena transkripční aktivitu pro-Col1a2 proximální promotor v přechodné transfekci experimenty pomocí fibroblastický buněčných linií. Odpovídající oblasti v lidském promotoru pro-COL1A2 byly také chráněny in vivo a in vitro footprinting experimenty (Ihn et al., 1996) a vázané transkripční aktivátory. Testy s gelovým posunem provedené za použití lidského promotoru pro-COL1A2 však naznačují, že cis-působící prvek umístěný při 2160 bp představuje represorový prvek (Ihn et al., 1996), což naznačuje, že interakce mezi proteiny interagující s aktivátorem prvky na 2300, 2125, a 280 bp a proteinů vazbou na repressor element na 2160 bp regulaci tohoto genu. V poslední době bylo prokázáno, že CUX1, CCAAT posunutí bílkovin, je spojena se snížením exprese kolagenu typu I in vivo a in vitro, a že zvýšení exprese CUX1 výsledky v efektivní potlačení kolagen typu I tím, že manipulují s CBF závazné (Fragiadaki et al., 2011).
bylo prokázáno, že Sp1 a Sp3 váží motiv TCCTCC umístěný mezi 2123 a 2128 bp; oba transkripční faktory aktivují tento promotor (Ihn et al., 2001) (viz obr. 13.2 B). Dále proteiny, které se vážou ke dvěma proximální segmenty také vázat k nejvíce proti proudu GC-bohaté segmentu, na 2300 bp, s výjimkou CBF, což naznačuje nadbytečnost mezi funkčně aktivní DNA segmenty pro-COL1A2 proximální promotor.
TGFß zprostředkovává její činnost v lidském promotor prostřednictvím kombinace všudypřítomné transkripční faktor Sp1, Smad3/4 komplexní, a coactivators p300/CREB vázající protein (CBP) v co se nazývá TGFß-citlivý prvek (TßRE) (Zhang et al., 2000). Tento segment obsahuje tři GC-bohaté motivy mezi 2330 a 2255, schopné vázat Sp1, CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP), activator protein 1 (AP1), a Smad komplexů (Chen et al., 1999, 2000a, b; Kanamaru et al., 2003; Tamaki a kol., 1995; Zhang et al., 2000). Interakce mezi těmito jadernými faktory je synergická a vyžaduje vazbu Sp1 a Smad3 / 4 na prvky bohaté na GC a na navazující místo Cagac Smad (Ghosh et al ., 2000; Poncelet a Schnaper, 2001; Zhang a kol., 2000). Na přelomu tohoto století proběhla velká debata o tom, zda jsou Smad důležitější než AP1 v proximálním promotoru. To byl vyřešen přibližně o 10 let později, když bylo prokázáno, že TGFß také aktivuje gen COL1A2 přes nekanonická (Smad-nezávislý) signální dráhy, která vyžaduje enhancer/promotor spolupráce zahrnující výměnu c-Jun/JunB transkripční faktor obsazenosti kritické enhancer stránky, což má za následek stabilizaci enhancer/promotor srůstání (Ponticos et al., 2009). Zpráva zkoumající účinky hypoxie a TGFß na gen COL1A2 přidala k potenciální úloze Smad, zejména Smad3, při regulaci exprese kolagenu. Tyto studie v lidských mesangiálních buněk naznačují, že za hypoxických podmínek a v přítomnosti TGFß, hypoxií indukovatelných faktor 1α (HIF-1α) a Smad3 mohou tvořit transkripční komplexy a přednostně posílit vazba na jeden ze tří hypoxia response elements v lidském COL1A2 pořadatel na pozici -335 bp (Baumann et al., 2016). Autoři naznačují, že tato nová interakce poskytuje mechanismus, který odpovídá za synergii pozorovanou mezi HIF a TGFß u fibrózy ledvin.
TNFa a interferon-γ (IFN-γ) potlačují produkci matrice. V kontrastu k jednotné DNA prvek, který zprostředkovává TGFß stimulace COL1A2 proximální promotor, a to jak TNFa a IFN-γ bylo prokázáno, že inhibují COL1A2 transkripce tím, že manipulují s tvorbou TGFß-indukované komplexní a stimulující interakce negativní faktory reagovat s DNA prvky se nachází 5′ a 3′. Tento takzvaný „cytokin citlivý prvek“ hraje důležitou roli při udržování homeostázy. Zapojení AP1 a NF-kB v transdukce inhibiční účinek TNFa na COL1A2 genové exprese byla prokázána pomocí zvěčněn fibroblastů od myší, které postrádají buď AP1 aktivátor Jun N-terminální kinázy 1 (JNK1) nebo NF-kB esenciální modulátor NEMO. Konkrétně ztráta JNK1 zabránila antagonismu TNFa tgfß, ale zachovala TNFa inhibici konstitutivní exprese COL1A2. TGFß antagonismu TNFa zahrnuje JNK1 fosforylace c-jun, což vede k off-DNA soutěže druhé molekuly pro Smad3 vazby na příbuzné DNA stránky a/nebo pro interakci s p300/CBP coactivators (Kouba et al., 1999; Verrecchia a kol., 2001, 2002).
Vazba IFN-γ na jeho receptory vede k tyrosin fosforylace janus kinázy (JAK) tyrosin kináz a to zase vede signál snímače a aktivátor transkripce (STAT1) fosforylace. V COL1A2 vede aktivace STAT1 ke konkurenci se Smad3 o interakci s p300 / CBP (Inagaki et al., 2003). Kromě toho, JAK1 můžete také aktivovat transkripční faktor, Y-box binding factor (YB-1); tato aktivace výsledky v obou inhibice konstitutivní promotor činnost prostřednictvím YB-1 vazba 2125TC box a antagonismus TGFß signály prostřednictvím YB-1 soutěž s Smad3 a/nebo p300/CBP (Ghosh et al., 2001; Higashi et al., 2003). Další podrobnosti viz „růstové faktory“ a „cytokiny“.“
bylo také prokázáno, že Est1/Fli1 váží stejnou sekvenci s opačnými účinky na transkripci kolagenu typu I. Funkční transkripční faktor Ets byl identifikován v COL1A2 v těsné blízkosti míst Sp1. Ets1 stimuloval, zatímco Fli1 inhiboval, promotorovou aktivitu. Vazba Sp1 byla nezbytná pro inhibici Fli1. Navíc nadměrná exprese Fli1 v dermálních fibroblastech vedla ke snížení hladin mRNA a bílkovin COL1A2 (Czuwara-Ladykowska et al ., 2001). Kromě toho, TGFß léčbě kožních fibroblastech vede k disociaci Ets1 z CBP/p300 komplexy a ovlivňuje jejich reakci na TGFß ve prospěch matice rozkladu (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).
Dále bylo prokázáno, že motiv CpG při 17 bp je přednostně methylován a vázán RFX proteiny v buňkách, které získávají kolagen i–negativní stav. Buňky transfekce experimenty ve spojení s DNA-vazebné testy mají přiřazen pozitivní nebo negativní vlastnosti každé bílkoviny vazba na proximální promotor pro-COL1A2 (Sengupta et al., 2002). Stupeň methylace v 17 CpG místě, na druhou stranu, bylo prokázáno, že modulují vazebnou afinitu RFX proteinů a tím i jejich schopnost downregulate promotor aktivita nábor související proteiny, které interferují s montáží pozitivně působící transkripční komplexy (Xu et al., 2003, 2004).