Dvou-dimenzionální polyakrylamidové gelové elektroforézy (2D-PAGE): pokroky a perspektivy

Úvod

posledních 25 let a zejména posledních deset let, byl svědkem zvýšeného úsilí na vývoj technologií umožňující identifikaci a kvantifikaci velkého počtu proteinů exprimovaných v buněčné systému (tj. proteomu) v naději, že detekce onemocnění biomarkery, mapování protein obvody, nebo nalézt nové fosforylace stránek, například. Složitost proteomu učinila z vývoje metod pro účinnou separaci a citlivou detekci proteinů kritickou součást tohoto úsilí. Pokračující pokroky v technologii hmotnostní spektrometrie (MS) umožnily detekci proteinů s mnohem větší rychlostí a citlivostí, než bylo dříve možné. Dokonce i špičkové MS, nicméně, není schopen charakterizovat všechny složky v komplexním proteomu. Vědci používají přístup“ rozdělit a dobýt “ k charakterizaci proteomů tím, že se pokoušejí dočasně omezit počet proteinů, které má hmotnostní spektrometr analyzovat. Rozložením proteomu bude nakonec analyzováno více proteinů v rámci individuálního experimentu.

k oddělení proteomů vědci používali elektroforetické a chromatografické technologie samostatně a v kombinaci a offline i online. Ačkoli toto úsilí může mít za následek separaci a identifikaci tisíců proteinů, žádná jediná metoda nemůže vyřešit všechny proteiny v proteomu kvůli jejich velkému počtu a dynamickému rozsahu koncentrace. Jednodimenzionální separace jsou nedostatečné pro účinné řešení komplexních proteinových směsí. Tato skutečnost byla uznána více než půl století před tím, Smithies a Poulik (1), který rozpoznal, že kombinace dvou elektroforetické postupy na gel v pravém úhlu by měla dát mnohem větší stupeň rozlišení, než je možné se buď samostatně. Tyto dva elektroforetické procesy jsou rozlišení podle molekulární velikosti a mobility volného roztoku na škrobovém gelu. Jejich predikce je i nadále prokázána jako pravdivá a vytvořila základ pro vývoj ortogonálních vícerozměrných metodik pro separaci komplexních směsí nejen gelovou elektroforézou, ale také chromatografií a kapilární elektroforézou.

abychom správně porozuměli pokrokům ve dvourozměrné stránce (2D-PAGE), musíme se vrátit mnohem dále než o čtvrt století. V roce 1930 představil Tiselius metodu pohybující se hranice jako analytický nástroj pro studium elektroforézy proteinů (2). Od jeho průkopnické práce byly pro separaci komplexních směsí proteinů použity různé formy elektroforézy, z nichž každá má lepší rozlišení. Již v roce 1962, Raymond a Aurell (3) byl prokázán významný nelineární účinky koncentrace gelu v elektroforetické mobility proteinů za použití 2-D elektroforéza pomocí různých akrylamidu gel koncentrace oddělit sérové proteiny. O dva roky později Raymond (4) prokázal nadřazenost gelů s plochou deskou ve srovnání s gely s válcovou trubicí. Například plochá deska poskytuje maximální plochu pro chlazení gel; výsledné vzory jsou jednodušší vyčíslit v standardní nahrávání denzitometrů; velký počet vzorků, které mohou být zpracovány pomocí jediného gel desky, usnadňující přímé srovnání vzorků zpracovaných podle stejných podmínek, a co je nejdůležitější, ploché desky umožňuje použití 2-D separace. Tyto bystré preference se ukázaly jako pravdivé a dnes se praktikují v mnoha bioanalytických laboratořích.

Další pokrok v 2-D gelu separace byl zaveden v roce 1972 Wright (5), kteří použili 4.75% (2% cross-linkage) polyakrylamidovém gelu kolony v první dimenzi, které se pak odstraní z skleněného válce a položeny na horním okraji o 2% spád desky. Po elektroforéze byla gelová deska umístěna do barvicího roztoku, což vedlo k vizualizaci 112 vyřešených lidských sérových proteinů.

tyto nové přístupy vyřešily pouze malý počet proteinů, především nejhojnější proteiny buněčného nebo sérového proteomu. Zavedení 2D-PAGE v roce 1975 O ‚ farrell (6) pro oddělení buněčné proteiny pod denaturace podmínky umožnily usnesení ze stovky proteinů. Použitý princip byl velmi jednoduchý: proteiny byly vyřešeny na gel pomocí izoelektrické fokusaci (IEF), která odděluje proteiny, v první dimenzi podle jejich izoelektrickému bodu, následuje elektroforéza v druhém rozměru v přítomnosti dodecyl sulfátu sodného (SDS), která dělí proteiny podle jejich molekulové hmotnosti. O ‚ Farrellova metoda je skutečně základem moderní 2D stránky, která byla rychle přizpůsobena a široce přijímána jinými výzkumníky. Anderson a Anderson (7) použili 2D stránku pro analýzu lidských plazmatických proteinů. Byli schopni oddělit a detekovat přibližně 300 odlišných proteinových skvrn po barvení. Na rozdíl od O ‚ Farrella oddělil Manabe (8) lidské plazmatické proteiny pomocí 2D-PAGE bez denaturačních látek. Na gelu bylo pozorováno asi 230 proteinových skvrn; skvrny však byly rozmazané a nebyly dobře vyřešeny.

zavedení imobilizovaných gradientů pH

jak bylo uvedeno výše, 2D-PAGE obsahuje IEF v první dimenzi, následovaný SDS-PAGE ve druhé dimenzi. Od svého zavedení Kolínem v roce 1954 (9) prošla IEF několika pokroky. První rozměr se provádí v polyakrylamidových gelových tyčích, které jsou vytvořeny ve skleněných nebo plastových trubkách a obsahují amfolyty, které tvoří gradient pH v elektrickém poli. Tyto pruty byly historicky nereprodukovatelné, nestabilní, a těžko s nimi pracovat. Zavedení imobilizovaných gradientů pH (IPGs) Bjellqvist et al. (10) mělo významný dopad na použití IEF k oddělování komplexních směsí v širokém rozmezí pH. IPGs umožnily tvorbu stabilních a reprodukovatelných pH gradientů schopných zaostřit kyselé a bazické proteiny na jediný gel připravený se širokými pH gradienty. V IPGs jsou nosné amfolyty připojeny k molekulám akrylamidu a odlévány do gelů za vzniku pevného gradientu pH. Upevnění gradientu zabraňuje driftu v gelu a také zajišťuje, že mohou být odlévány účinným a reprodukovatelným způsobem. Použití úzkých pásů IPG umožnilo oddělit větší počet proteinů, než bylo možné u standardní 2D stránky, protože užší rozsah pH byl rozložen na větší fyzickou vzdálenost. Toto šíření umožnilo oddělit proteiny s podobnými hodnotami izoelektrického bodu (pI) s vyšším rozlišením. Pro ilustraci tohoto bodu, Hoving et al. vyvinuli metodu 2D stránek, ve které aplikovali pásky IPG s úzkým rozsahem v první dimenzi (11). IPG pásy byly typicky 1-3 pH u široké a vzájemně se překrývaly alespoň 0,5 pH u.bylo použito šest IPG pásů pokrývajících rozsah pH 3,5 až 10. Proteiny z buněčné linie B-lymfomu byly aplikovány na každý pás a odděleny pomocí IEF. Každý proužek byl poté aplikován na individuální gelovou desku SDS-PAGE a proteiny byly odděleny ve druhé dimenzi na základě jejich molekulové hmotnosti. Přibližně 5000 odlišných skvrn bylo detekováno pomocí šesti proužků IPG, ve srovnání s 1500 skvrnami detekovanými pomocí jediného proužku IPG s rozsahem pH 3-10 a jedné standardní 2D-stránkové gelové desky. Wildgruber et al. (12) porovnalo použití 3 IPG proužků s rozsahy pH 4-5, 5-6 a 5,5-6,7 proti gelům běžícím s proužky IPG s rozsahy gradientu pH 3-10 a 4-7. Byli schopni detekovat 2,3 a 1, 6× více proteinových skvrn pomocí tří pásů IPG s úzkým rozsahem než u dvou pásů IPG s širším gradientem (3-10 a 4-7).

Zatímco vyšší rozlišení, které lze získat pomocí více překrývajících úzké IPGs umožňuje identifikaci více bílkovin, každá úzký pás vyžaduje samostatnou gel desky a určité množství stejného vzorku má být naloženo na každém. Tento požadavek znamená, že pokud je objem nebo koncentrace vzorku omezená, nemusí být takový experiment možný. U omezených vzorků by mělo být zváženo širší rozmezí pH nebo minimální počet IPG.

dvourozměrná diferenciální elektroforéza v gelu (2D-DIGE)

cíl separace proteinů pomocí 2D-PAGE je dvojí: i) identifikace nových proteinů a ii) měření jejich relativní hojnosti mezi srovnávacími vzorky. Jednou z výhod 2D-PAGE jako separační techniky je, že nejen řeší velké množství proteinů, ale barvení těchto proteinů umožňuje kvantifikovat relativní hojnost proteinů. Například proteiny extrahované ze dvou vzorků séra (zdravé a nemocné) jsou naloženy na samostatnou gelovou desku. Po zbarvení jsou proteinové skvrny zarovnány a skenovány, aby se změřily jejich jednotlivé intenzity. I když bylo dosaženo mnoha pokroků v nástrojích pro zarovnání softwaru,bylo náročné zajistit přímé srovnání mezi dvěma samostatnými gely. Vývoj 2-D diferenciál v-gelová elektroforéza (DIGE) v roce 1997 překonal toto omezení tím, že umožňuje až tři různé proteinové směsi, které mají být odděleny v rámci jednoho 2D-PAGE gelu (13). V typické 2D-DIGE experiment, proteiny extrahované ze tří různých vzorků, zdravé, nemocné, a vnitřní kontroly (směsný vzorek tvořen z míchání stejné množství bílkoviny extrahované z zdravé a nemocné vzorky), jsou kovalentně značené, každý s kyanová fluorescenční barvivo, které má různé excitační a emisní vlnové délky. Vzorky jsou migrovány, takže stejný protein značený některým z barviv bude migrovat do stejné polohy na gelu. Kyaninová barviva, která byla použita, jsou: 1-(5-karboxy-pentyl)-1′-propylindocarbacyanine halogenid N-hydroxysuccinimidyl ester (Cy3); 1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindodicar-bacyanine halogenid N-hydroxysuccinimidyl ester (Cy5); a 3-(4-karboxymethyl)phenylmethyl-3′-ethyloxacarbacyanine halogenid N-hydroxysuccinimidyl Ester (cy2). Stejné koncentrace různě značených proteinů a kontrolního vzorku jsou smíchány, aplikovány na jednu gelovou desku a odděleny pomocí 2D stránky. Kontrolní vzorek slouží jako interní standard, umožňující vzájemné i intra-gelové párování. Kontrolní vzorek by měl obsahovat všechny bílkoviny přítomné ve všech vzorcích v experimentu. To znamená, že každý protein v experimentu má unikátní signál vnitřního standardu, který se používá pro přímé kvantitativní srovnání v rámci jednotlivých gel a normalizovat kvantitativní množství hodnot pro každý protein mezi gely. Skenování gelu na specifických excitačních vlnových délkách každého barviva pomocí fluorescenčního imageru umožňuje vizualizaci diferencovaně značených proteinů (Obrázek 1). Obrazy jsou pak sloučeny a analyzovány pomocí zobrazovacího softwaru, který umožňuje porovnávat rozdíly mezi úrovněmi hojnosti proteinů. Hodnota v DIGE eliminuje jakoukoli chybu související s vychýlením gelu a zajišťuje přesnou kvantifikaci (14).

Proteiny zájmu jsou vyříznuty z gelu, proteolytically stravitelné, a identifikovány pomocí MS. Protože to se provádí pomocí jediného gel desky, 2D-DIGE vyžaduje o 50% méně gely, takže je úspornější a rozdíly v proteinové expresi mezi dvěma různými vzorky proteinů jednodušší porovnat a přesněji odrážel. Kromě toho je k detekci proteinových skvrn zapotřebí méně času, protože reakce značení v DIGE je rychlejší než vizualizace pomocí barvicích metod. Pokud je potřeba porovnat úrovně exprese proteinu dvou různých vzorků, je metodou volby DIGE (15).

Silné a Slabé stránky z 2D-PAGE

Elektroforéza je založena technika, která prošla několika záloh, které mají větší rozlišení, detekci, kvantifikaci, a reprodukovatelnost. 2-D SDS-PAGE a 2D-DIGE přístupy k proteinové profilování jsou dostupné a ekonomické metody, které mají vysokou rozlišovací schopnost a umožňují detekci stovek proteinů na jediném gelu desky. Ačkoli Reprodukovatelnost byla problémem s 2D stránkou, zejména při profilování dvou proteinových směsí, byla výrazně vylepšena použitím 2D-DIGE. Rozlišení bylo vylepšeno zavedením IPG, které analytikovi umožňují přizpůsobit pH gradient pro maximální rozlišení pomocí ultrazoomových gelů s úzkým rozsahem pH gradientu. S moderní 2D-PAGE, to není neobvyklé, aby vyřešit dva proteiny, které se liší v pI o 0.001 U

i když 2D-PAGE byla omezena jeho neschopnost vyřešit proteiny, které jsou příliš jednoduché, nebo příliš kyselé, příliš velké nebo příliš malé, toto omezení je neustále klesající. Například separace bazických proteinů může být analyzována pomocí IPGs v rozmezí pH 4-12. Separační věda se neustále vyvíjí a nebude trvat dlouho, než budou zbývající problémy gelové elektroforézy adekvátně vyřešeny.

zavedení 2D-DIGE nesmírně přispělo k řešení problémů reprodukovatelnosti a kvantifikace. Použití snímačů a počítačů umožňuje nejen rychlé dolování, získávání a analýzu dat, ale také detekci skvrn, normalizaci, profilování proteinů, korekci pozadí a reporting a export dat. Jako separační, detekční a kvantitativní technika je 2D-DIGE důležitým nástrojem, zejména pro klinické laboratoře podílející se na stanovení hladin exprese proteinu a objevu biomarkerů onemocnění. Pokud je hlavním cílem absolutní biologická variace mezi vzorky, jako při objevu biomarkerů, 2D-DIGE je metoda volby.

Zatímco došlo k významnému pokroku v nongel (nebo řešení-based) metody pro tažné frakcionace metody přímo on-line s MS analýzu, 2D-PAGE zůstal populární technika pro provádění proteomic studií. Ačkoli 2D-PAGE, stejně jako jakékoli frakcionační schéma, má své výhody a nevýhody,není pochyb o tom, že zůstane nezbytnou technikou pro charakterizaci proteomů po mnoho dalších let.