Pravidlo založené na modelu inzulinové signální dráhy

model inzulínové signální dráhy

od tří publikovaných modelů , jsme zavedli model ISP, jak je znázorněno na Obr. 1 použití grafické notace systémové biologie .

model obsahuje mnoho podstatných prvků zodpovědný za působení inzulínu od tří hlavních sub-cesty ISP, stručně popsáno v následujícím textu, jsou zahrnuty.

dráha PI3K-AKT

pro dráhu PI3K-Akt většinou odkazujeme na model v Sedaghat et al. . Model byl použit několika výzkumnými skupinami a zahrnuje mnoho z nejznámějších signalizačních komponent zprostředkovávajících translokaci glukózového transportéru GLUT4. Patří sem insulin receptor a recyklovat subsystémů; post-receptorová signalizační subsystém, včetně Ser – Tyr – fosforylace na inzulínový receptor substrate1 (IRS1); vznik komplexu (IRS1_PI3K komplex) mezi fosforylovaný IRS1 a phosphatidylinositide 3-kinázy (PI3K), fosfatidylinositol 3,4,5-trisphosphates PI(3,4,5)P3, syntéza; fosforylace proteinkinázy B (AKT) a proteinkinázy C (PKC)-ζ; translokace GLUT4 na plazmatickou membránu. V modelu jsou také zvažovány účinky proteinové tyrosinfosfatázy (PTP1B) a lipidových fosfatáz (SHIP2 a PTEN).

dráha TSC1 / 2-mTOR

pro dráhu TSC1/2-mTOR většinou odkazujeme na model nedávno publikovaný v Sonntag et al. , popisující účinek mTOR v reakci na inzulín a aminokyseliny. Model zvažuje oba komplexy mTOR: mTORC1 a mTORC2. aktivace mTORC1 je závislá na přítomnosti aminokyselin a je inhibována aktivací proteinů tuberózní sklerózy 1 a 2 (TSC1/2) (tj. Aktivace AMPK závisí na fosforylaci IRS1 Tyr, zatímco inhibice TSC1/2 (tj. fosforylace Tyr) závisí na fosforylaci AKT při Thr309. mTORC2, který byl nedávno identifikován jako neznámá fosfoinositid-dependentní protein kináza 2 (PDK2), tj. kináza zodpovědná za fosforylaci AKT Ser474 přispívá k dvojité fosforylaci AKT spolu s fosforylací Thr309, provozovanou fosfoinositid-dependentní protein kinázou 1 (PDK1). Sonntag et al. formulujte hypotézu přítomnosti varianty PI3K, která je přímo regulována aktivovaným inzulínovým receptorem a následně aktivuje mTORC2. Tuto hypotézu jsme zahrnuli do našeho modelu.

dráha RAS-MAPK

pro dráhu RAS-MAPK většinou odkazujeme na model v Borisově et al. , popisující jak EGF, tak inzulínové stimulace. Model obsahuje všechny hlavní chemické mechanismy zapojené v RAS-MAPK dráhy: interakce Tyr fosforylovaný IRS1 se SHP2 (SH2 doménu obsahující protein tyrosin kinázy 2) a GRB2-SOS komplex (growth factor receptor-bound 2 a son of sevenless složité), a tak tvoří SHP2-IRS1 a GRB2/SOS-IRS1 komplexy, respektive; GTP – vázající RAS; fosforylací RAF proto-onkogenu serin/threonin-protein kináz (c-RAF); interakce insulin receptor s Ras GTPase activating protein (RASGAP), což katalyzuje opačný proces Ras spolujezdce; aktivaci proto-onkogenu tyrosin-protein kináza SRC, který plně aktivuje c-RAF; dvojí specifičnost mitogen-aktivované kinázy 1/2 (MEK1/2); extracelulární signál-regulované kinázy (ERK1/2).

Integrace PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR a RAS-MAPK dráhy

PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR a RAS-MAPK dráhy obsahují několik překrývajících se částí, které v původních dokumentech, byly často modelovány různými způsoby, že je založena na mírně odlišné předpoklady. Porovnali jsme překrývající se reakce napříč různými modely a implementovali jejich nejaktuálnější verzi na základě současných znalostí buněčné biochemie. Integrace tří modelů navíc vyžadovala řešení různých měrných jednotek přijatých k popisu stavových proměnných. Vzhledem k tomu, immunoblot experimenty umožňují získat důležité informace týkající se časového plánu signalizačních událostí, kvantitativní informace o expresi bílkovin jsou často problematické získat tak, že předpokládané koncentrační profily jsou někdy hlášeny v mikromolární koncentraci, stejně jako v Borisov et al. , nebo v libovolných jednotkách (AU), jako v Sonntag et al. . V porovnání, v Sedaghat et al. koncentrace byly vyjádřeny buď v molárních jednotkách, nebo v procentech celkové koncentrace (např. koncentrace GLUT4 cytosolu byla považována za 96 % celkové koncentrace GLUT4 v buňce při výchozím stavu).

RBM potenciálně umožňuje provádět deterministické i stochastické simulace za předpokladu, že veličiny proměnných jsou vyjádřeny v kopiích molekul na buňku. I když jsme v této práci nepoužívali stochastickou simulaci, zarovnali jsme všechny proměnné na stejnou jednotku, tj. počet molekul na buňky vynásobením molárních jednotek NA * V(NA označuje Avogadro číslo a V objem buněk, považovaný za rovný 3e-12 l). Všechny podrobnosti o převodu jednotek z AU a procentních koncentrací jsou uvedeny v materiálu a metodách.

výsledný model se skládá ze 42 reakčních pravidel a 101 parametrů kódujících interakce mezi 61 odlišnými chemickými druhy. Reakce, hodnoty parametrů a počáteční podmínky jsou uvedeny v doplňkovém souboru 1.

Novinky MKP-ISP model

MKP implementace, usnadnit účetnictví pro řadu ISP funkce, jako je například fosforylace signalizačních proteinů na více místech a s více efekty, simultánní interakce molekul s různými závazné partnery a subcelulární lokalizace některých reakcí. Výše uvedené charakteristiky jsou podrobně popsány v následujícím textu.

Fosforylace signalizačních proteinů na více místech

Signalizační molekuly mohou mít různé úrovně aktivity, v závislosti na které zbytky jsou fosforylované. Vezměme si například IRS1 a akt. IRS1 má mnoho zbytky potenciálně zapojených v post-translační modifikace a může být aktivován nebo inhibován v jeho kinázy akce, v závislosti na fosforylované zbytky být Tyra nebo Ser . Například fosforylace Tyr-896 je nutná pro vazbu PI3K, SHP2 a GRB2, zatímco fosforylace ser-636 p70s6k je mechanismus související s inzulínovou rezistencí . AKT může být naopak aktivován fosforylací při Thr309 nebo Ser474 PDK1 a mTORC2 .

aktivace/inhibice závislá na fosforylaci IRS1 byla již zahrnuta do modelu Sedeghat, i když s ohledem na fosforylaci ser regulovanou PKC a nikoli p70S6K, jako v modelu Sonntag. Zde jsme modelovali jak PKC, tak p70s6k akce a popsali pIRS1-Tyr896 komplexní formování / disociaci s PI3K, SHP2 a GRB2 .

dvě fosforylační místa AKT nebyla explicitně modelována v Sedaghat et al. . Modelovali jsme fosforylaci AKT při Thr zprostředkovanou PI (3,4,5) P3 jako v Sedaghat et al. model a fosforylace AKT na Ser zprostředkovaná mTORC2 jako v Sonntag et al. model a předpokládá:

i)
AKT fosforylována buď na Thr nebo oba weby jednat o TSC1/2 komplexní zprostředkováním jeho fosforylace na Tyr a dephosphorylation na Ser ;
ii)
fosforylace AKT na Ser nebo oba weby k inaktivaci C-RAF ;
iii)
AKT fosforylací na Thr nebo Ser aktivovat translokace GLUT4 .

Interakce s více závazné partnery

interakce molekuly v signálních drah s mnoha různých závazné partnery výsledky v potenciální vznik různých komplexů. V ISP může IRS1 fosforylovaný na Tyr-896 vázat PI3K, jak je modelováno v Sedaghat et al. nebo GRB2 / SOS a SHP2, jak je modelováno v Borisově et al. . Abychom odpovídali specifikaci modelu RBM-ISP se současnými znalostmi, umožnili jsme tvorbu různých komplexů. Tak, IRS1 se může vázat na vzájemně se vylučující, způsob, GRB2/SOS a SHP2, ale může vázat současně GRB2/SOS a p85 regulační podjednotky PI3K .

Informace o subcelulární lokalizace v reakci pravidla

možnost, že proteiny mají komunikovat je často souvisí s jejich tělesné lokalizace, tj. jejich přítomnost v extracelulární prostor, cytoplazma, jádro, plazmatická membrána, atd. Například lipidy PI (3,4,5) P3 fungují jako dokovací místa pro plazmatické membrány, která rekrutují různé proteiny obsahující pleckstrinové homologické (PH) domény (např. AKT a PDK1) a jejich ko-lokalizace může urychlit konkrétní signalizační události . Dalším příkladem je interakce mTORC1 s Ras homolog obohacený v mozku (RHEB) a Hadr rodinou na lysosome membrány, uvádí Zoncu et al. . V našem modelu jsme zařadili informace o subcelulární lokalizace pro inzulínový receptor a GLUT4 transportéru, přičemž se rozlišuje mezi jejich plazmatické a cytoplazmatická lokalizace podle matematického popisu Sedaghat et al. .

Model předpovědi

spojení profilů všech druhů chemických vyplnění modelu byly simulovány na 60 min, 100 nM inzulínové stimulaci. Koncentrace 100 nM představuje dobře přijímanou úroveň stimulace inzulínu v buněčných kulturách, které se běžně vyskytují v literatuře a používají se také naší skupinou . Podle Sonntag et al. , předpokládali jsme také konstantní stimulaci aminokyselin, nezbytnou pro získání aktivace mTORC1 a zpětné vazby p70S6K na IRS1. Pro posouzení spolehlivosti modelu byly porovnány modelové předpovědi s experimentálními daty dostupnými v našem datovém souboru pro některé fosfoproteiny v čase 2, 5, 10, 30 a 60 minut po stimulaci inzulínem plus aminokyselinami, tj. Jak je znázorněno na obr. 2, experimentální a předpověděl profily pAKT-S473 a pmTORC1-S2448 jsou v dobré shodě, protože oba ukazují zvyšující se fosforylaci vzor dosažení ustáleného stavu v prvních 2-5 min a 20-30 min, respektive. Předpokládaný profil pro ppERK1 / 2-Y202, Y204 je potvrzen experimentálními daty v prvních 10 minutách, zatímco v posledních časových bodech rychle klesá v experimentálních datech s ohledem na modelové předpovědi. Profil pozorované v experimentálních dat pro ppERK1/2-Y202,Y204, by mohlo být více úzce uzavřeno rozšiřovat sílu zpětné vazby mezi ppERK1/2-Y202,Y204 a GRB2/SOS. Na Obr. 2 (pravý horní panel, Tečkovaná čára) je zobrazen simulovaný profil ppERK1 / 2-Y202, Y204 získaný vynásobením parametru kcat39 (viz další soubor 1) faktorem 10. Všimněte si, že v MKP ISP model k dispozici on-line, jsme se rozhodli opustit parametr modelu beze změny, tj. použijeme hodnoty z literatury , odložení optimalizace parametrů pro budoucí studium, když další data budou k dispozici. Bohužel, experimentální data z pP70S6K-T389 nebyly spolehlivé (pouze jedno opakování k dispozici), takže nemůžeme porovnat experimentální a simulované profily pro tento protein, který je koncový bod dráhy s důležitou zpětnou vazbu akce na IRS1. Nicméně simulovaný profil znázorněný na obr. 2 (dolní, pravý panel) připomíná experimentální data uvedená v jiných dokumentech .

Jsme zkoumal předpokládané profily všech účinných druhů a clusteru je do čtyř skupin podle jejich dynamické chování, jak je znázorněno na Obr. 3:

Rychlá reakce, dosažení ustáleného stavu během 2-5 min (modrá)
Rychle přestřelení reakce, dosahuje vrcholu během 2-5 min a pak v rovnovážném stavu po dobu 10-20 min (zelená)
Pomalé odezvy, dosažení ustáleného stavu v 10-20 min (oranžová)
Pomalu přestřelení reakce, dosažení vrcholu v 5-10 min. a v ustáleném stavu v 30-60 min (fialová).

po stimulaci inzulínem inzulínový receptor rychle reaguje fosforylací a spouští kaskádu událostí podél odlišných cest. Podél dráhy PI3K-AKT jsou všechny mechanismy úzce související s IRS1 Tyr – fosforylací charakterizovány rychlou odezvou. Totéž platí i pro jiné přímé cíle IRS1 fosforylován na Tyr podél TSC1/2-mTOR kaskáda, tj. fosforylace AMPK v T172, SHP2-IRS1 a GRB2/SOS-IRS1 komplexů tvorbu. Rychlá odezva je charakterizována buď rychlý růst, aby se v ustáleném stavu nebo přechodné překročení následuje ustálený stav, v závislosti na nepřítomnost/přítomnost mechanismů zpětné vazby, které působí na cílovou molekulu (případ 1 a 2, v modré a zelené, respektive, v Obr. 3). Mechanismy většinou tvoří TSC1/2-mTOR dráhy a hraje roli v Ser – fosforylace IRS1 jsou charakteristické relativně pomalu, ne-překročení reakce (případ 3, oranžová na Obr. 3). Jak bylo pozorováno výše, dráha RAS-MAPK předpokládá ve svých upstreamových složkách rychlou odezvu, která se znatelně zpomalí pro navazující (případ 4, Fialová na obr. 3).

obecně platí, že molekuly navazující cesta, týkající se relativně pomalé procesy, jako jsou transkripční aktivace, nebo interakce s prostředím vně buňky, jako ERK1/2 a GLUT4, jsou charakterizovány tím, pomalý reakce vzhledem k tomu, že molekuly proti proudu, cestou se vyznačují rychlou odezvou tak, aby vyvolat rychlé šíření signálu. V této souvislosti překročení reakci následuje návrat do ustáleného stavu by mohlo pomoci, aby se dosáhlo rychlého šíření signálu na jeden signalizační trasy, takže molekuly opět k dispozici pro další signalizační trasy bezprostředně po.

Model předpovědi v absenci kontrolních mechanismů

počet simulací pak byly provedeny, aby prošetřila robustnost systému na dvě cílové účinky ISP: translokace GLUT4 a ERK1/2 fosforylace. Zejména byla analyzována úloha dvou hlavních kontrolních mechanismů při regulaci cílových účinků:

P70S6K-IRS1 záporná zpětnovazební smyčka (červená čára na obr. 1);
erk1/2-GRB2 / SOS negativní zpětnovazební smyčka (modrá čára na obr. 1);

za tímto účelem byl porovnán časový průběh odpovědi GLUT4 a ERK1/2 za přítomnosti a nepřítomnosti dvou výše uvedených regulačních mechanismů (obr. 4). Dynamický dvojnásobně hladinu fosforylovaného ERK1/2 je silně ovlivněny oba P70S6K-IRS1 a ERK1/2-GRB2/SOS negativní zpětnou vazbu. Na druhou stranu, ustálený stav a dynamické chování GLUT4 do membrány nejsou ovlivněny ERK1/2, ale jsou silně ovlivněny tím, P70S6K-IRS1 negativní zpětnou vazbu, což potvrzuje pozoruhodný význam tento kontrolní mechanismus při určování systémové dynamiky.

je dobře známo, že inzulinová rezistence je spojena s defekty v IRS-závislá signalizace, svědčí, že jeho dysregulace v iniciaci a progresi metabolických onemocnění. Vznikající názor je, že pozitivní/negativní regulace IRS autologní cesty je převrácený v nemoci tím, že zvýšená bazální a další časově nevhodné serin/threonin fosforylace , což vede ke snížené vychytávání glukózy. Kompenzační hyperinzulinémie může v tomto bodě vzrůst a nakonec vést k cukrovce. I když IRS1 (a IŘS2) jsou regulovány prostřednictvím komplexní mechanismus zahrnující fosforylaci více než 50 různých serin/threonin reziduí v našem modelu P70S6K-IRS1 negativní zpětné vazby se zdá zásadní pro dobrou kontrolu vychytávání glukózy. Zvýšení negativní zpětné vazby P70S6K-IRS1 je schopno vysvětlit sníženou citlivost na inzulín a vychytávání glukózy (obr. 5). Podobně (i když také předpokládají pozitivní zpětnou vazbu od mTOR k jinému irs1 serinovému zbytku), Brännmark et al. použití minimálního modelu signalizace inzulínu ukazuje, že snížený mechanismus pozitivní zpětné vazby je schopen vysvětlit sníženou absorpci glukózy.

Na druhou stranu, jak P70S6K-IRS1 a ERK1/2-GRB2/SOS negativní zpětná vazba smyčky zdát nezbytné zaručit, že dvojnásobně hladinu fosforylovaného ERK ukazuje přechodové chování, s vrcholem na 10 min, následuje návrat do základní stav. Toto chování bylo již popsáno v literatuře pod inzulinovým stimulem a pod stimulem epidermálního růstového faktoru . Přechodná odpověď ERK zabraňuje trvalé aktivaci ERK, která by vedla k kontinuální buněčné proliferaci .

analýza Citlivosti

dále zkoumat roli dva hlavní kontrolní mechanismy v regulaci cílových účinky, lokální analýza citlivosti byla provedena nanesením malého rozrušení (0.1 % hodnoty parametru) na jeden parametr modelu najednou a vyhodnocení výsledných relativních změn translokace GLUT4 a fosforylace ERK1/2 (viz metody). Tabulky 1 a 2 ukazují koeficient citlivosti parametrů modelu, zařadil proto, aby se jejich absolutní hodnoty a ve srovnání s hodnotou koeficientů předpokládejme, po odstranění P70S6K-IRS1 a ERK1/2-GRB2/SOS negativní zpětnou vazbu. Tyto koeficienty měří celkový účinek změny parametru na výsledek, tj. GLUT4 a ERK odpověď, tj. během pozorovacího okna. Kladné / záporné hodnoty znamenají, že zvýšení hodnoty parametru má za následek zvýšení / snížení odezvy. Vzhledem k tomu, malé absolutní hodnoty znamenají, že parametr změny nemají podstatný vliv na výsledek, v Tabulkách 1 a 2, pouze koeficient větší než 0,1 % (absolutní hodnota), a to buď v původní nebo upravený model, jsou hlášeny.

Tabulka 1 Parametrické analýzy citlivosti kompletní model pro GLUT4 membrány translokace

Tabulka 2 Parametrické analýzy citlivosti kompletní model pro ERK1/2 aktivace

Parametrické analýzy citlivosti kompletní model pro GLUT4 odpovědí vyplývá, že nejvíce citlivé jsou parametry vztahující se k translokaci GLUT4 do plazmatické membrány, následuje těch, které se týkají lipidů, tvorbě a IRS1_PI3K komplexní tvorba/disociace. Absence zpětné vazby p70S6K_IRS1 má silný dopad na zvýšení citlivosti (absolutní hodnoty) parametrů souvisejících s tvorbou lipidů a tvorbou/disociací komplexu IRS1_PI3K.

Parametry týkající se základní fosforylace IRS1/dephosphorylation na Tyr/Ser, mají nižší citlivost, což zmenšuje (absolutní hodnota), obecně, tím, že odstraní P70S6K-IRS1 zpětnou vazbu, s výjimkou parametru k7p, týkající se IRS1 fosforylace na Ser. Parametry související s PKC zprostředkovanou fosforylací IRS1 při Ser také vykazují zvýšené hodnoty po odstranění zpětné vazby P70S6K-IRS1. Od ERK1/2-GRB2/SOS zpětnou vazbu odstranění nemá žádný vliv na translokaci GLUT4, citlivosti koeficientů se nemění s a bez této zpětné vazby.

Parametrické analýzy citlivosti kompletní model pro ERK1/2 reakce ukazuje, že nejvíce citlivé jsou parametry týkající se RAS, MEK a RAF aktivace a IRS1 fosforylace na Tyr a Ser, to druhé zprostředkované p70S6K.Podél obou PI3K-AKT a RAS-ERK1/2 dráhy, ERK1/2-GRB2/SOS zpětnou vazbu, se zdá, důležitou roli na robustnost systému. Dynamika systému je slabě ovlivněna jeho nepřítomností(viz obr. 4), zatímco citlivost parametru se zvyšuje (v absolutní hodnotě) téměř ve všech případech, pokud je tato zpětná vazba odstraněna.

závěry o účinku zpětné vazby P70S6K-IRS1 na odpověď ERK1 / 2 jsou kontroverznější. Odstranění této zpětné vazby má za následek snížení citlivosti parametrů podél cesty PI3K_AKT, zatímco podél dráhy RAS-ERK1 / 2 nemá téměř žádný účinek na parametry související s fosforylací MEK, inaktivací RAF a fosforylací ERK. Snižuje citlivost na parametry související s RAS, aktivací RAF a narušením komplexu IRS1-GRB2 / SOS a IRS1-SHP2. Silně zvyšuje citlivost parametrů souvisejících s aktivací SRC A RAF.

tyto výsledky zdůrazňují ústřední roli negativních zpětnovazebních smyček při určování nejen dynamiky biologického systému, ale také jeho robustnosti. Tato vlastnost je pozoruhodný význam, protože zachovává dynamické chování systému proti hluku a malé biologické výkyvy běžně důsledku mezibuněčné variabilita.