Faktoren, die an den proximalen Promotor pro-COL1A2 binden
Im proximalen Promotor des Maus-Pro-Col1a2-Gens (154-2350 bp) und in der humanen Minimalsequenz zwischen 152 und 2378 bp wurden mehrere funktionelle cis-wirkende Elemente identifiziert. Der erste Transkriptionsfaktor, der an diesen Promotor bindet, war das ubiquitäre CCAAT-bindende Protein CBF. Dieser Transkriptionsfaktor wird von drei separaten Untereinheiten namens A, B und C gebildet, die alle kloniert und sequenziert wurden (Maity und de Crombrugghe, 1998). Alle drei Untereinheiten werden benötigt, damit CBF an die Sequenz bindet, die die CCAAT-Box zwischen 284 und 280 enthält, und die Transkription sowohl in menschlichen als auch in Mausgenen aktiviert (siehe Abb. 13.2B). In-vitro-Daten legen nahe, dass sich die A– und C-Untereinheiten zuerst zu einem A-C-Komplex assoziieren und dass dieser Komplex dann mit der B-Untereinheit ein heteromeres Molekül bildet (Sinha et al., 1995). Mutationen in der CCAAT-Box, die die Bindung von CBF verhindern, verringern die Transkriptionsaktivität des proximalen Promotors pro-Col1a2 in transienten Transfektionsexperimenten fibroblastischer Zelllinien um das Drei- bis Fünffache (Coustry et al., 1995). Gereinigtes CBF sowie CBF, das aus seinen drei rekombinanten Untereinheiten besteht, aktivieren auch den Pro-Col1a2-Promotor in zellfreien Kernextrakten, die zuvor an CBF abgereichert waren (Coustry et al., 1995). Zwei der drei Untereinheiten von CBF enthalten transkriptionelle Aktivierungsdomänen. In jüngerer Zeit deutete eine einzelne Substitution von T zu einem A in vivo in Gegenwart eines Upstream-Enhancers der humanen Sequenz darauf hin, dass CBF an der Strukturierung der Kollagen-Typ-I-Expression in der dorsoventralen sowie der rostrocaudalen Achse von Maushautfibroblasten beteiligt ist (Tanaka et al., 2004).
Zusätzlich zur Bindungsstelle für CBF identifizierten Footprinting-Experimente und Gel-Shift-Studien weitere Bindungsstellen in den ersten 350 bp des Maus-Promotors pro-Col1a2. Es wurde gezeigt, dass drei GC-reiche Sequenzen, die sich bei etwa 2160 bp (zwischen 2176 und 2152 bp) und 2120 bp (zwischen 2131 und 2114 bp) befinden, durch Footprint-Experimente und Gel-Shift-Assays mit DNA-bindenden Proteinen interagieren (Hasegawa et al., 1996). Eine Deletion im Maus-Promotor, die diese drei Footprinted-Sequenzen umfasste, hob die transkriptionelle Aktivität des proximalen Promotors pro-Col1a2 in transienten Transfektionsexperimenten mit fibroblastischen Zelllinien vollständig auf. Die entsprechenden Regionen im humanen Pro-COL1A2 Promotor wurden auch in in vivo und in vitro Footprinting Experimenten geschützt (Ihn et al., 1996) und gebundene Transkriptionsaktivatoren. Gel-Shift-Assays, die unter Verwendung des humanen Pro-COL1A2-Promotors durchgeführt wurden, deuten jedoch darauf hin, dass ein cis-wirkendes Element bei 2160 bp ein Repressorelement darstellt (Ihn et al., 1996), was impliziert, dass Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die mit den Aktivatorelementen bei 2300, 2125 und 280 bp interagieren, und Proteinen, die an ein Repressorelement bei 2160 bp binden, dieses Gen regulieren. In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass CUX1, ein CCAAT-Verdrängungsprotein, sowohl in vivo als auch in vitro mit einer verringerten Expression von Typ-I-Kollagen assoziiert ist und dass eine Verstärkung der Expression von CUX1 zu einer wirksamen Unterdrückung von Typ-I-Kollagen führt, indem die CBF-Bindung gestört wird (Fragiadaki et al., 2011).
Es wurde gezeigt, dass Sp1 und Sp3 das TCCTCC-Motiv zwischen 2123 und 2128 bp binden; beide Transkriptionsfaktoren aktivieren diesen Promotor (Ihn et al., 2001) (siehe Abb. 13.2B). Darüber hinaus binden Proteine, die an die beiden proximalen Segmente binden, mit Ausnahme von CBF auch an das am weitesten stromaufwärts liegende GC-reiche Segment bei 2300 bp, was auf eine Redundanz zwischen funktionell aktiven DNA-Segmenten des proximalen Promotors pro-COL1A2 hindeutet.
TGFß vermittelt seine Wirkung im humanen Promotor durch die Kombination des ubiquitären Transkriptionsfaktors Sp1, des Smad3/4-Komplexes und der Coaktivatoren p300/CREB-bindendes Protein (CBP) in einem sogenannten TGFß-responsive Element (TßRE) (Zhang et al., 2000). Dieses Segment enthält drei GC-reiche Motive zwischen 2330 und 2255, die Sp1, CCAAT / Enhancer-bindendes Protein (C / EBP), Aktivatorprotein 1 (AP1) und Smad-Komplexe binden können (Chen et al., 1999, 2000a,b; Kanamaru et al., 2003; Tamaki et al., 1995; Zhang et al., 2000). Die Wechselwirkung zwischen diesen Kernfaktoren ist synergistisch und erfordert die Bindung von Sp1 und Smad3 / 4 an die GC-reichen Elemente bzw. an die nachgeschaltete CAGAC-Smad-Stelle (Ghosh et al., 2000; Poncelet und Schnaper, 2001; Zhang et al., 2000). Um die Jahrhundertwende gab es eine große Debatte darüber, ob Smads im proximalen Promotor wichtiger sind als AP1. Dies wurde etwa 10 Jahre später behoben, als gezeigt wurde, dass TGFß auch das COL1A2-Gen über einen nichtkanonischen (Smad-unabhängigen) Signalweg aktiviert, der eine Enhancer / Promotor-Kooperation erfordert, die den Austausch der c-Jun / JunB-Transkriptionsfaktor-Belegung einer kritischen Enhancer-Stelle beinhaltet, was zur Stabilisierung der Enhancer / Promotor-Koaleszenz führt (Ponticos et al., 2009). Ein Bericht, der die Auswirkungen von Hypoxie und TGFß auf das COL1A2-Gen untersucht, hat die potenzielle Rolle von Smads, insbesondere Smad3, bei der Regulierung der Kollagenexpression erhöht. Diese Studien an humanen Mesangialzellen legen nahe, dass Hypoxie-induzierbarer Faktor 1α (HIF-1α) und Smad3 unter hypoxischen Bedingungen und in Gegenwart von TGFß Transkriptionskomplexe bilden und bevorzugt die Bindung an eines der drei Hypoxie-Antwortelemente innerhalb des humanen COL1A2-Promotors an Position -335 bp verstärken können (Baumann et al., 2016). Die Autoren schlagen vor, dass diese neuartige Interaktion einen Mechanismus bietet, der die Synergie zwischen HIF und TGFß bei Nierenfibrose erklärt.
TNFa und Interferon-γ (IFN-γ) unterdrücken die Matrixproduktion. Im Gegensatz zu dem einzelnen DNA-Element, das die TGFß-Stimulation des proximalen COL1A2-Promotors vermittelt, wurde gezeigt, dass sowohl TNFa als auch IFN-γ die COL1A2-Transkription hemmen, indem sie die Bildung des TGFß-induzierten Komplexes stören und die Interaktion von negativen Faktoren mit responsiven DNA-Elementen stimulieren, die sich 5 ‚und 3‘ davon befinden. Dieses sogenannte „Cytokine responsive Element“ spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase. Die Beteiligung von AP1 und NF-kB an der Transduktion der inhibitorischen Wirkung von TNFa auf die COL1A2-Genexpression wurde unter Verwendung von immortalisierten Fibroblasten von Mäusen gezeigt, denen entweder der AP1-Aktivator Jun N-terminal Kinase 1 (JNK1) oder der NF-kB fehlt essentieller Modulator NEMO. Insbesondere verhinderte der Verlust von JNK1 den TNFa-Antagonismus von TGFß, bewahrte jedoch die TNFa-Hemmung der konstitutiven COL1A2-Expression. Der TGFß-Antagonismus durch TNFa beinhaltet die JNK1-Phosphorylierung von c-jun, was zu einer Off-DNA-Konkurrenz des letzteren Moleküls für die Smad3-Bindung an die verwandte DNA-Stelle und / oder für die Interaktion mit den p300 / CBP-Coaktivatoren führt (Kouba et al., 1999; Verrecchia et al., 2001, 2002).
Die Bindung von IFN-γ an seine Rezeptoren führt zur Tyrosinphosphorylierung von Januskinase (JAK) -Tyrosinkinasen und dies wiederum führt zu Signalwandler und Aktivator der Transkription (STAT1) Phosphorylierung. In COL1A2 führt die STAT1-Aktivierung zu einer Konkurrenz mit Smad3 um die Interaktion mit p300 / CBP (Inagaki et al., 2003). Darüber hinaus kann JAK1 auch den Transkriptionsfaktor Y-Box-Bindungsfaktor (YB-1) aktivieren; Diese Aktivierung führt sowohl zur Hemmung der konstitutiven Promotoraktivität durch YB-1-Bindung der 2125TC-Box als auch zum Antagonismus von TGFß-Signalen durch YB-1-Konkurrenz mit Smad3 und / oder p300 / CBP (Ghosh et al., 2001; Higashi et al., 2003). Weitere Einzelheiten finden Sie unter „Wachstumsfaktoren“ und „Zytokine.“
Es wurde auch gezeigt, dass Est1 / Fli1 dieselbe Sequenz mit entgegengesetzten Effekten auf die Transkription von Kollagen Typ I binden. Ein funktioneller Ets-Transkriptionsfaktor wurde in COL1A2 in unmittelbarer Nähe von Sp1-Stellen identifiziert. Ets1 stimulierte, während Fli1 die Promotoraktivität inhibierte. Die Sp1-Bindung war essentiell für die Hemmung von Fli1. Darüber hinaus führte die Überexpression von Fli1 in dermalen Fibroblasten zu einer Abnahme der COL1A2-mRNA- und Proteinspiegel (Czuwara-Ladykowska et al., 2001). Darüber hinaus führt die TGFß-Behandlung dermaler Fibroblasten zur Dissoziation von Ets1 von den CBP / p300-Komplexen und verändert deren Reaktion auf TGFß zugunsten des Matrixabbaus (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein CpG–Motiv bei 17 bp bevorzugt methyliert und durch RFX-Proteine in Zellen gebunden ist, die einen Kollagen-I-negativen Zustand annehmen. Zelltransfektionsexperimente in Verbindung mit DNA-Bindungstests haben jedem der Proteine, die an den proximalen Promotor von pro-COL1A2 binden, positive oder negative Eigenschaften zugeordnet (Sengupta et al., 2002). Andererseits wurde gezeigt, dass der Methylierungsgrad an der 17-CpG-Stelle die Bindungsaffinität von RFX-Proteinen moduliert und folglich ihre Fähigkeit, die Promotoraktivität herunterzuregulieren, indem assoziierte Proteine rekrutiert werden, die den Zusammenbau positiv wirkender Transkriptionskomplexe stören (Xu et al., 2003, 2004).