Die aktive Form dnaA ist an ATP gebunden. Unmittelbar nach der Teilung einer Zelle ist der Gehalt an aktivem dnaA in der Zelle niedrig. Obwohl die aktive Form von dnaA ATP erfordert, erfordert die Bildung des oriC / dnaA-Komplexes und das anschließende Abwickeln der DNA keine ATP-Hydrolyse.
Die orische Stelle in E. coli hat drei AT-reiche 13-Basenpaarregionen (DUEs), gefolgt von vier 9-bp-Regionen mit der Sequenz TTAT (C oder A)CA(C oder A)A. Etwa 10 dnaA-Moleküle binden an die 9-bp-Regionen, die sich um die Proteine wickeln, wodurch sich die DNA an der AT-reichen Region abwickelt. Es gibt 8 dnaA-Bindungsstellen innerhalb von oriC, an die dnaA mit differentieller Affinität bindet. Wenn die DNA-Replikation beginnt, besetzt dnaA alle Bindungsstellen mit hoher und niedriger Affinität. Die denaturierte AT-reiche Region ermöglicht die Rekrutierung von DnaB (Helikase), die mit DnaC (Helikase Loader) komplexiert. DnaC hilft der Helikase, an die ssDNA an der 13 bp-Region zu binden und sie richtig unterzubringen; Dies wird durch ATP-Hydrolyse erreicht, wonach DnaC freigesetzt wird. Einzelstrangbindungsproteine (SSBs) stabilisieren die einzelnen DNA-Stränge, um die Replikationsblase aufrechtzuerhalten. DnaB ist eine 5’→3′ Helicase, also reist es auf dem nacheilenden Strang. Es verbindet sich mit DnaG (einer Primase), um den einzigen Primer für den führenden Strang zu bilden und RNA-Primer auf dem nacheilenden Strang hinzuzufügen. Die Wechselwirkung zwischen DnaG und DnaB ist notwendig, um die Länge von Okazaki-Fragmenten auf dem nacheilenden Strang zu kontrollieren. Die DNA-Polymerase III ist dann in der Lage, die DNA-Replikation zu starten.
dnaA besteht aus vier Domänen: die erste ist das N-Terminal, das mit regulatorischen Proteinen assoziiert ist, die zweite ist eine helikale Linkerregion, die dritte Domäne ist eine AAA + -Region, die an ATP bindet, und die vierte Domäne ist die C-terminale DNA-Bindungsregion. dnaA enthält zwei konservierte Regionen: Die erste befindet sich im zentralen Teil des Proteins und entspricht der ATP-Bindungsdomäne, die zweite befindet sich in der C-terminalen Hälfte und ist an der DNA-Bindung beteiligt.