Abstract
Ligustrum vicaryi L. ist ein Hybrid aus Ligustrum ovalifolium Hassk. var. aureo-marginatum und Ligustrum vulgale L., gehören zur Familie der Oleaceae. Es wird oft als Zierstrauch wegen seiner goldenen Blätter verwendet. Sein medizinischer Wert muss jedoch noch entdeckt werden. In jüngster Zeit haben Pflanzenpolysaccharide aufgrund ihrer biologischen Eigenschaften, einschließlich immunmodulatorischer und antioxidativer Aktivitäten, umfassende Aufmerksamkeit erregt. Diese Studie zielte darauf ab, das Polysaccharid aus der Ligustrum vicaryi L.-Frucht zu extrahieren, zu reinigen und zu charakterisieren und seine immunmodulatorischen und antioxidativen Aktivitäten zu untersuchen. Das Ligustrum vicaryi L.-Fruchtpolysaccharid (LVFP) wurde durch Ultraschallextraktion, Ethanolfällung, makroporöse Harztrennung und Dialysebeutelreinigung erhalten. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des LVFP wurden mittels Fourier-Transform-Infrarotspektrometrie, Hochleistungs-Ionenchromatographie und Hochleistungs-Gelfiltrationschromatographie aufgeklärt. Die Ergebnisse zeigten, dass das LVFP aus Rhamnose, Arabinose, Galactose und Glucose in einem Verhältnis von 1,79: 7,55: 4,58: 1,54 bestand und sein Molekulargewicht 88.949 Da betrug. Die immunmodulatorischen und antioxidativen Aktivitäten des LVFP wurden unter Verwendung eines Cyclophosphamid- (Cy-) induzierten immunsupprimierten Mausmodells untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass das LVFP die Milz- und Thymusindizes signifikant erhöhte, die Phagozytenfunktion von Neutrophilen, aktivierten B- und T-Lymphozyten verbesserte und die Serumspiegel von IL-10 und TNF-α hochregulierte. Darüber hinaus beobachteten wir, dass das LVFP Cy-induzierte Leberschäden durch Erhöhung der Superoxiddismutase- (SOD) und Glutathionperoxidase- (GSH-px) Spiegel linderte. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass das LVFP die immunmodulatorischen und antioxidativen Aktivitäten besitzt und somit eine Grundlage für die Anwendung des LVFP in der pharmazeutischen und funktionellen Lebensmittelindustrie bildet.
1. Einleitung
Immunmodulatoren können als vorbeugende oder therapeutische Strategien eingesetzt werden, die die Abwehrreaktion des Wirts verstärken oder unterdrücken. Natürliche Produkte mit immunmodulatorischen und antioxidativen Funktionen werden häufig zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt, darunter Autoimmunerkrankungen, entzündliche Erkrankungen und Krebs . In letzter Zeit hat das Interesse an kostengünstigen und weniger toxischen Naturprodukten gegenüber der Verwendung synthetischer Chemotherapeutika zugenommen.
Ligustrum vicaryi L. ist eine Hybride aus Ligustrum ovalifolium Hassk. var. aureo-marginatum und Ligustrum vulgale L., gehören zur Familie der Oleaceae . Es zeigt einen chlorophyllfreien Phänotyp und wird aufgrund seiner goldenen Blätter häufig als Gartenbaustrauch verwendet. Entsprechend den Gasaustauscheigenschaften und Chlorophyllfluoreszenzreaktionen kann Ligustrum vicaryi L. SO2 widerstehen und kann somit zur Phytostabilisierung von Cd-kontaminierten Böden verwendet werden . Obwohl Ligustrum vicaryi L. einen hohen Zier- und Umweltschutzwert hat, ist sein therapeutisches Potenzial noch nicht geklärt.
Pflanzenpolysaccharide, eine Klasse wichtiger biologischer Makromoleküle, die üblicherweise in traditionellen Heilkräutern vorkommen, weisen eine Reihe biologischer Aktivitäten auf, einschließlich antioxidativer, immunmodulatorischer, anti-Aging-, Antitumor- und entzündungshemmender Aktivitäten . In den letzten Jahren gab es viele Studien zur Extraktion und Bioaktivitätsanalyse von pflanzlichen Polysacchariden. Pflanzenfruchtpolysaccharide sind die am häufigsten erforschten, einschließlich der Jujube-Polysaccharide , Persimmon-Polysaccharide und Wassermelonen-Polysaccharide . Nach unserem besten Wissen wurde keine Studie zur Herstellung und Bioaktivität von Ligustrum vicaryi L.-Fruchtpolysacchariden (LVFPs) berichtet.
In dieser Studie wurde das LVFP extrahiert und gereinigt. Als nächstes wurden das Molekulargewicht und die Monosaccharidzusammensetzung des LVFP analysiert. Darüber hinaus wurden die biologischen Funktionen des LVFP in einem Cyclophosphamid- (Cy-) induzierten immunsupprimierten Mausmodell untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass das LVFP immunmodulatorische Fähigkeiten besitzt, indem es sowohl angeborene als auch adaptive Immunität aktiviert. Darüber hinaus zeigte das LVFP eine antioxidative Aktivität durch Erhöhung der Superoxiddismutase (SOD) und der Glutathionperoxidase (GSH-px). Diese Studie präsentierte eine theoretische Grundlage für die Entwicklung des LVFP als alternatives therapeutisches Mittel gegen immunbedingte Erkrankungen.
2. Materialien und Methoden
2.1. Tierschutz- und Ethikerklärungen
Alle Versuchsverfahren entsprachen den Empfehlungen der ARRIVE-Richtlinien (animal research: reporting in vivo experiments). Das Institutional Animal Care and Use Committee der Jining Medical University genehmigte die Verfahren. Alle experimentellen Verfahren wurden so human wie möglich durchgeführt. Insgesamt 100 gesunde männliche Kunming-Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g wurden unter Bedingungen untergebracht, die 12 h eines künstlichen Dunkel-Hell-Zyklus aufrechterhielten, wobei Nahrung und Wasser ad libitum zur Verfügung standen. Die Tiere wurden in Standardtierräumen mit einer Temperatur von 20-22 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 55-60% untergebracht.
2.2. Extraktion und Reinigung von Polysaccharid
Ligustrum vicaryi L. früchte wurden aus dem botanischen Garten der Jining Medical University (Rizhao, Shandong, China) gewonnen und von Jianan Wang (Medizinischer Botaniker, School of Pharmacy, Jining Medical University) identifiziert. Getrocknete Ligustrum vicaryi L. Früchte wurden pulverisiert und durch ein 40-Mesh-Sieb gesiebt. Das Pulver wurde in Aceton getaucht (das Verhältnis von Pulver zu Aceton betrug 1: 3) und 24 h geschüttelt, um Lipide zu entfernen. Der Überstand wurde verworfen und die Reste im Ofen getrocknet. Das Polysaccharid wurde mit destilliertem Wasser 8:1 (v/w) bei 50°C für 80 min mit einer Ultraschallleistung von 250 W extrahiert. Der Wasserextrakt wurde mit Baumwolle filtriert. Der Rückstand wurde nach 3 min Zentrifugation bei 3000 upm entfernt. Anschließend wurde der aufkonzentrierte Überstand mit 70% igem Ethanol gefällt und dieser Vorgang mit 95% igem Ethanol wiederholt. Nach Entfernung des Überstandes wurde zur Lösung des Extraktes destilliertes Wasser zugegeben und der Rückstand durch Zentrifugation entfernt. Das makroporöse Harz DM101 wurde verwendet, um das Pigment zu entfernen. Das Sevage-Reagenz (Chloroform/1-Butanol, v/v = 4 : 1) wurde verwendet, um das Protein zu entfernen, bis keine Verfärbungsreaktion unter Verwendung des Coomassie Brilliant Blue G-250-Nachweises beobachtet wurde. Die Polysaccharide wurden für 24 h in einen Gefriertrockner gegeben, um das gefrorene Pulver zu erhalten. Die kleinen Moleküle im Polysaccharid wurden unter Verwendung eines Dialysebeutels (molekularer Cutoff von 3500 Da) für zwei Tage entfernt und destilliertes Wasser wurde alle 12 h ersetzt. Säulenchromatographie Sephadex G-200 wurde verwendet, um das LVFP zu reinigen. Der Anthron-Schwefelsäure-Assay mit einer Glucosestandardkurve wurde verwendet, um die Reinheit des LVFP zu bestimmen.
2.3. Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR) -Analyse
Das LVFP wurde mit reinem Kaliumbromidpulver gemischt, und die Mischung wurde in einen Achatmörser gegeben und gleichmäßig unter einer Infrarotlampe gemahlen. Die Mischung wurde mit dem Fourier-Transform-Infrarotspektrometer IRTracer-100 (Shimadzu, Japan) beurteilt.
2.4. Hochleistungs-Ionenchromatographie (HPIC)
Zur HPIC-Analyse wurden 5 mg LVFP in 1 ml 2 mol/L Trifluoressigsäure gelöst und zur Hydrolyse 2 h bei 121°C vorgelegt. Anschließend wurde das Gemisch mit einer 0,45 µm mikroporösen Filtrationsmembran filtriert. Die chromatographische Trennung von Monosacchariden wurde am Ionenchromatographen ICS-5000 durchgeführt, der mit einer CarboPac PA20-Säule und einem Puls-Ampere-Detektor ausgestattet war. Die ionenchromatographischen Trennbedingungen wurden eingestellt und auf eine Mischung von acht Monosaccharidstandards (Fucose, Rhamnose, Arabinose, Galactose, Glucose, Xylose, Mannose und Fructose) getestet. Eine überlegene Trennung wurde durch Gradientenelution mit einer konstanten Flussrate von 0,5 ml/min erhalten. Die mobile Phase bestand aus 250 mM NaOH (A), Wasser (enthaltend 1 M NaAc%, v/v, B) und Wasser (C). Die Elution erfolgte wie folgt: 2.0% A bei 0∼21 min; 2,0% A und 5,0% B bei 21,1 min; 2,0% A und 20% B bei 21,1∼30 min; und 80% A bei 30,1∼50 min.
2.5. Hochleistungs-Gelfiltrationschromatographie (HPGFC)
Die Polysaccharidmolekularmasse wurde von HPGFC (Waters, New York, USA) analysiert und mit dem RID (2414 Refractive Index Detector) und Empower 3 Workstation ausgestattet. Die chromatographischen Bedingungen waren wie folgt: Chromatographische Säule: Ultrahydrogel™ Linear, 300 mm × 7,8 mm × 2, mobile Phase: 0,1 M NaNO3, Flussrate: 0,9 ml/min und Säulentemperatur: 45°C. Die Probe wurde in der flüssigen Phase gelöst und durch eine mikroporöse Filtrationsmembran filtriert. Molekulargewichtsstandards, die für die Kalibrierkurve verwendet wurden, waren MW135350, MW36800, MW9750, MW2700 und MW180.
2.6. Cyclophosphamid- (Cy-) induziertes immunsuppressives Mausmodell und LVFP-Verabreichung
Insgesamt 100 Mäuse wurden zufällig in fünf Gruppen eingeteilt: Kontrolle, Cy, Cy + LVFP (100 mg / kg / Tag), Cy + LVFP (200 mg / kg / Tag) und Cy + LVFP (400 mg / kg / Tag). Der Kontrollgruppe wurde normale Kochsalzlösung verabreicht, und den anderen vier Gruppen wurde sieben Tage lang täglich intraperitoneal Cy (40 mg / kg) injiziert. Das LVFP wurde durch intragastrische Verabreichung an sieben aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht.
2.7. Bestimmung der Milz- und Thymusindizes
Alle Mäuse wurden 24 h nach der letzten Arzneimittelverabreichung gewogen und geopfert. Milz und Thymus wurden herausgeschnitten und gewogen. Der Milz- oder Thymusindex wurde als Verhältnis des Gewichts der Milz oder des Thymus zum Körpergewicht ausgedrückt.
2.8. Bestimmung der phagozytischen Funktion von Maus-Neutrophilen
Staphylococcus aureus wurde verwendet, um die Phagozytose von Neutrophilen zu beurteilen. Kurz gesagt, 40 µL Blut wurden von Mäusen nach LVFP-Verabreichung erhalten und in ein Heparinröhrchen gegeben, um eine Gerinnung zu verhindern. Anschließend wurden 40 µL Bakteriensuspension in das oben genannte Röhrchen gegeben. Die Mischung wurde gleichmäßig auf Objektträger beschichtet und 0,5 h bei Raumtemperatur gehalten. Dann wurde die Mischung mit 2-3 Tropfen Methanol für 5 min fixiert und mit 4-5 Tropfen Wright’s Stain für 5 min angefärbt. Insgesamt wurden 100 Neutrophile beobachtet und aufgezeichnet. Die neutrophile Phagozytenrate und der neutrophile Phagozytenindex wurden wie folgt berechnet: Die Neutrophile Phagozytenrate = die Anzahl der Neutrophilen, die eine Phagozytenfunktion aufwiesen / die Gesamtzahl der Neutrophilen und der Neutrophile Phagozytenindex = die Gesamtzahl der Bakterien, die von Neutrophilen verschlungen worden waren / die Gesamtzahl der Neutrophilen.
2.9. Bestimmung von Serum-Hämolysin durch ELISA
Am vierten Tag wurden den Mäusen 5% einer Hühner-Erythrozyten (CRBC)-Suspension intraperitoneal injiziert (0,1 ml/10 g). Am siebten Tag, 2 h nach LVFP-Verabreichung, wurde 1 ml Mäuseblut gewonnen und 10 min zentrifugiert. Dann wurden 40 µL Serum zu 2 ml normaler Kochsalzlösung gegeben. Ein ml 10% Meerschweinchenserum und 1 ml 5% CRBC-Suspension wurden zu dem Serum gegeben, gefolgt von einer Inkubation in einem Wasserbad bei 37 °C für 0,5 h. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Überstand wurde in eine 96-Well-Kulturplatte gegeben. Der entsprechende optische Dichtewert wurde mit dem Thermo Scientific Multiskan MK3 Enzyme Mark Instrument (Waltham, MA, USA) detektiert.
2.10. Bestimmung der T-Lymphozyten-Transformationsrate
Am zweiten Tag wurden den Mäusen 8 mg/kg Phytohämagglutinin (PHA) intramuskulär injiziert. Am siebten Tag, 2 h nach der LVFP-Verabreichung, wurden 40 µL Blut aus dem Retroorbitalsinus entnommen, auf einen Objektträger gelegt und mit 4-5 Tropfen Wright-Fleck angefärbt. Der überschüssige Farbstoff wurde nach 20 min mit Wasser gespült. Unter Verwendung eines Mikroskops wurden 100 Zellen beobachtet. Die transformierten Lymphozyten wurden wie folgt berechnet: Lymphozytentransformationsrate = transformierte Lymphozyten / Gesamtzahl der Lymphozyten.
2.11. Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH)
Die DTH-Reaktion wurde anhand des Grades der Ohrschwellung untersucht. Im Allgemeinen wird angenommen, dass der Grad der Ohrschwellung den Grad der Entzündung widerspiegelt . Das DTH-Ansprechen wurde wie folgt gemessen: Am zweiten Tag wurde 1 cm2 Bauchhaar mit Na2S entfernt und die Bauchhaut mit 25 µL 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (DNFB)-Lösung bedeckt. Am sechsten Tag wurde die Haut am rechten Ohr mit 20 µL DNFB-Lösung beschichtet. Am siebten Tag, 2 h nach der LVFP-Verabreichung, wurden die Mäuse geopfert und die beiden Ohren herausgeschnitten und gewogen. Der Gewichtsunterschied zwischen den beiden Ohren bestimmte den Grad der Ohrschwellung.
2.12. Nachweis von TNF-α- und IL-10-Zytokinen im Serum
Am siebten Tag, 2 h nach LVFP-Verabreichung, wurde das Mäuseblut unter Verwendung einer retroorbitalen Sinuspunktion gewonnen und 15 min bei Raumtemperatur auf natürliche Weise koaguliert. Anschließend wurde das Blut für 20 min zentrifugiert und der Überstand gesammelt. TNF-α und IL-10 im Überstand wurden mittels ELISA-Kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) nachgewiesen.
2.13. Nachweis von Superoxiddismutase (SOD), Glutathionperoxidase (GSH-Px) und Methandicarbonaldehyd (MDA)
Am achten Tag wurden die Mäuse getötet und die Lebern extrahiert. Nach Mahlen und Zentrifugieren wurde der Überstand von Lebergewebe zum Nachweis von SOD, GSH-px und MDA gesammelt. SOD, GSH-px und MDA wurden mit ELISA-Kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) gemessen.
2.14. Hämatoxylin- und Eosin (HE) -Färbung
Die HE-Färbung wurde wie zuvor berichtet durchgeführt . Am achten Tag wurden die Mäuse geopfert und Lebergewebe extrahiert und in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert. Nach dem Einbetten in Paraffin wurden die Gewebe in 5 µm-Schnitte geschnitten. Dann wurden die Objektträger mit HE gefärbt, um morphologische Veränderungen zu bestimmen. Die Bilder wurden unter einem Lichtmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) fotografiert.
2.15. Statistische Analyse
Versuchspersonen / Präparate wurden zufällig Gruppen zugeordnet, und gleiche Gruppengrößen wurden erhalten. Gruppenzuweisungen, Datenaufzeichnung und Datenanalyse wurden dem Prüfer nicht mitgeteilt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD aus mindestens fünf unabhängigen Experimenten angezeigt. Eine Einweg-ANOVA, begleitet von Tukeys Multiple-Comparisons-Test, wurde für Mehrfachvergleiche mit GraphPad Prism Version 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) verwendet und als statistisch signifikant angesehen.
3. Ergebnisse
3.1. FTIR-Spektrumanalyse von LVFP
Das LVFP wurde durch Lipidentfernung über Aceton, Heißwasser in Kombination mit Ultraschallextraktion, Ethanolfällung, Pigmententfernung durch makroporöses Harz, Deproteinierung mit dem Sevage-Reagenz bzw. Darüber hinaus wurde die neue Polysaccharidstruktur durch Infrarotspektroskopie charakterisiert. Die FTIR-Spektrumanalyse des LVFP ist in Abbildung 1(a) dargestellt. Der charakteristische Broad Peak bei 3345 cm−1 entsprach der O-H (vielleicht einschließlich N-H) Streckschwingung. Die Absorptionsspitze bei 2929 cm−1 entsprach der C-H-Streckschwingungsabsorptionsspitze und der Zuckerabsorptionsspitze. Die Absorption bei 1599 cm−1 zeigte die Biegevibrationsmodi von -OH an. Der Peak bei 1412 cm−1 resultierte aus dem Vorhandensein von C-H-Biegevibrationen. Weiterhin gaben die Absorptionen bei 1073 cm−1 die Biegeschwingungsmoden der C-O-Streckung in der alkoholischen Hydroxylgruppenform an.
3.2. Monosaccharidzusammensetzung von LVFP
Die Monosaccharidzusammensetzungen des LVFP wurden von HPIC analysiert. Wie in den Abbildungen 1 (b) und 1 (c) gezeigt, wurden alle in Polysacchariden vorhandenen Monosaccharide gemäß der Elutionszeit der Monosaccharidstandards unter Bezugnahme auf eine Standardkurve identifiziert. Das LVFP bestand hauptsächlich aus Rhamnose, Arabinose, Galactose und Glucose im Molverhältnis 1,79: 7,55: 4,58: 1,54.
3.3. Bestimmung des Molekulargewichts von LVFP durch HPGFC
Das Molekulargewicht des LVFP wurde durch HPGFC nachgewiesen. Dextrane (Molekulargewicht: 180, 2700, 9750, 368000 und 135350 Da) wurden als Standards verwendet, da sie wasserlöslich sind und in einem weiten Bereich von Molekülmassen zur Verfügung stehen. Die Standards lieferten Richtlinien zur Schätzung der Größe des LVFP. Es wurde eine Standardkurve erhalten (y = -0,523x + 13,01, R2 = 0,995). Die Ergebnisse zeigten, dass das Molekulargewicht des LVFP 88.949 Da betrug.
3.4. Wirkungen von LVFP auf Thymus- und Milzindizes bei Cy-induzierten immunsuppressiven Mäusen
Das Cy-induzierte immunsupprimierte Mausmodell wurde etabliert, um die immunmodulatorische Aktivität des LVFP zu untersuchen. Cy wurde sieben Tage lang täglich als intraperitoneale Injektion (40 mg /kg) verabreicht. Nach fünf Tagen Cy-Verabreichung zeigten die Mäuse Symptome wie Haarausfall, geringe Erregung, Aggression, Appetitlosigkeit und Gewichtsverlust, während in der Kontrollgruppe keine offensichtliche Veränderung beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass das Tiermodell erfolgreich etabliert wurde. Cy + LVFP-Gruppen erhielten an sieben aufeinanderfolgenden Tagen unterschiedliche Konzentrationen des LVFP (100, 200 und 400 mg / kg / Tag). Milz- und Thymusindizes spiegeln die Immunfunktionen des Organismus wider . Die LVFP-Effekte auf die Thymus- und Milzindizes in den Cy-induzierten immunsuppressiven Mäusen sind in Abbildung 2 dargestellt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die Cy-Gruppe eine signifikante Abnahme der Thymus- und Milzindizes. Die LVFP-Verabreichung erhöhte diese Indizes dosisabhängig signifikant. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass das LVFP die Immunorgane beeinflussen könnte, um die Immunität zu verbessern.
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3.5. Wirkungen von LVFP auf die Neutrophilen-Phagozytose bei Cy-induzierten immunsuppressiven Mäusen
Neutrophile sind eine wirksame Abwehr gegen eindringende Mikroorganismen . Phagozytose ist eine Schlüsselstrategie für Neutrophile bei der Abtötung von Krankheitserregern . Die Phagozytenrate und der Phagozytenindex wurden untersucht, um die Aktivierung von Neutrophilen zu untersuchen . Wie in Abbildung 3 gezeigt, hatte die Cy-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant reduzierte Phagozytenrate und einen Phagozytenindex, was auf einen immunsuppressiven Status hindeutet. Die Verabreichung von LVFP (200 mg / kg und 400 mg / kg) linderte diese Veränderungen signifikant. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das LVFP die phagozytische Funktion von Neutrophilen verbessern kann.
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3.6. Auswirkungen von LVFP auf die humorale Immunität und zelluläre Immunität bei Cy-induzierten immunsuppressiven Mäusen
Die humorale Immunität ist für den Körper entscheidend, um Tumore und Infektionen zu bekämpfen. Der Serum-Hämolysin-Spiegel kann verwendet werden, um die humorale Immunantwort zu bewerten . Das Serum-Hämolysin wurde durch Cy-Behandlung verringert, und diese Änderung wurde durch das LVFP dosisabhängig signifikant abgeschwächt (Abbildung 4 (a)). Eine Vielzahl von Antigenen aus Blut kann T-Lymphozyten aktivieren. PHA kann als Mitogen wirken, um die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen auszulösen . Der T-Lymphozyten-Transformationstest wurde unter Verwendung von Mausblut nach PHA-Stimulation in Gegenwart oder Abwesenheit des LVFP durchgeführt. Wie in Abbildung 4 (b) gezeigt, hemmten alle drei Dosen des LVFP die Cy-induzierte Reduktion der T-Lymphozyten-Transformationsrate deutlich. Die DTH-Antwort ist eine T-Zell-vermittelte Immunantwort . Das DTH-Ansprechen wurde durch Messung des Grades der Ohrschwellung beurteilt. Alle drei Dosen des LVFP schwächten die Cy-induzierte Hemmung im Grad der Ohrschwellung deutlich ab (Abbildung 4 (c)). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das LVFP B- und T-Lymphozyten aktivieren kann.
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3.7. Wirkungen von LVFP auf die Expression von IL-10 und TNF-α im Serum von Cy-induzierten immunsuppressiven Mäusen
Zytokine, die von Immunzellen sezerniert werden, spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr des Wirts . IL-10 und TNF-α sind wichtige Entzündungsmediatoren . ELISA wurde durchgeführt, um die Auswirkungen des LVFP auf die Serumexpression von IL-10 und TNF-α festzustellen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die IL-10- und TNF-α-Expression nach Cy-Behandlung signifikant verringert waren. Die Verabreichung von LVFP erhöhte dosisabhängig die IL-10- und TNF-α-Spiegel (Abbildung 5).
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3.8. Auswirkungen von LVFP auf oxidativen Stress bei Cy-induzierten immunsuppressiven Mäusen
Darüber hinaus wurde in dieser Studie untersucht, ob das LVFP Cy-induzierten oxidativen Stress und Leberschäden lindert. SOD wandelt das Superoxidanion in H2O2 und O2 um, um die durch freie Radikale verursachten Schäden zu verhindern und zu neutralisieren. Es wird vermutet, dass GSH-px eine wichtige endogene Abwehr gegen die peroxidative Zerstörung der Zellmembran darstellt . MDA ist das Endprodukt der Lipidperoxidation und kann die oxidativen Schäden im Lebergewebe widerspiegeln . Die Abbildungen 6 (a) -6 (c) zeigen die signifikant verringerten SOD- und GSH-px-Expressionen mit erhöhten MDA-Spiegeln im Lebergewebe nach Cy-Behandlung. Die Verabreichung des LVFP erhöhte dosisabhängig die SOD- und GSH-px-Spiegel und senkte den MDA-Spiegel. Als nächstes wurden die Veränderungen der Lebermorphologie mittels HE-Färbung beurteilt. Wie in Abbildung 6 (d) gezeigt, waren die Leberzellen in der Cy-Gruppe spärlich und mit dem pyknotischen Kern ungeordnet. Die hepatischen Sinusoide waren voller roter Blutkörperchen. Wie erwartet waren die Leberzellen in der LVFP-Gruppe geordnet mit einem klaren Nukleolus angeordnet, vergleichbar mit denen in der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse zeigten, dass das LVFP den durch Cy induzierten oxidativen Stress und Leberschäden abschwächen könnte.
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4. Diskussion
In dieser Studie wurde ein Polysaccharid aus der Ligustrum vicaryi L.-Frucht extrahiert und seine immunmodulatorischen und antioxidativen Aktivitäten bewertet. Das Polysaccharid wurde durch Heißwasser in Kombination mit Ultraschallextraktion, Ethanolfällung, Fettentfernung durch Aceton, Pigmententfernung durch makroporöses DM101-Harz, Deproteinierung mit dem Sevage-Reagenz (Chloroform / 1-Butanol, v / v = 4: 1) und niedermolekulare Entfernung unter Verwendung des Dialysebeutels extrahiert. Darüber hinaus wurde diese Polysaccharidstruktur durch Infrarotspektroskopie, HPGFC-RID und HPIC charakterisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das Molekulargewicht des LVFP 88.949 Da beträgt und das LVFP aus vier Monosacchariden besteht, nämlich Rhamnose, Arabinose, Galactose und Glucose im Molverhältnis 1,79: 7,55: 4,58: 1,54.
Immunsuppression ist ein Zustand vorübergehender oder permanenter Immunfunktionsstörung und kann einen Organismus empfindlicher gegenüber Krankheitserregern machen. Die Entwicklung neuer immunmodulatorischer Wirkstoffe ist eine der wirksamsten Methoden zur Vorbeugung und Behandlung immunsuppressiver Erkrankungen . Zum Beispiel scheinen immunmodulatorische Mittel in Kombination mit Chemotherapeutika in der Krebstherapie nützlich zu sein . Mehrere Berichte haben positive Korrelationen zwischen den immunmodulatorischen Wirkungen und Polysacchariden gezeigt. Ayeka et al. gezeigt, dass das Lakritz (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) Polysaccharid hat immunmodulatorische Wirkungen, die durch die Aktivierung von CD4 + – und CD8 + -Immunzellpopulationen und eine erhöhte Produktion verschiedener Zytokine wie IL-2, IL-6 und IL-7 offensichtlich sind . In: Chen et al. isolierte Polysaccharide aus Schisandra sphenanthera und Schisandra chinensis; diese Extrakte könnten die phagozytische Aktivität von Makrophagen verbessern und die Immunität des Körpers verbessern . Berichten zufolge wurde beobachtet, dass die Polysaccharide aus Schisandra sphenanthera und Schisandra chinensis hauptsächlich aus Arabinose, Glucose und Galactose bestanden, ähnlich der Zusammensetzung des LVFP. Um zu untersuchen, ob das LVFP immunmodulatorische Funktionen besitzt, wurde ein Cy-induziertes immunsupprimiertes Mausmodell etabliert. Cy ist ein Chemotherapeutikum und wurde verwendet, um immunsuppressive Tiermodelle zu etablieren . Auf der Ebene der Immunorgane zeigten die Ergebnisse, dass das LVFP die Milz- und Thymusindizes bei Cy-induzierten immunsuppressiven Mäusen signifikant erhöhte. Auf der Ebene der Immunzellen wurde beobachtet, dass das LVFP die phagozytische Funktion von Neutrophilen verstärkte und die Aktivierung von B- und T-Lymphozyten förderte. Diese Daten zeigen, dass das LVFP sowohl die angeborene als auch die adaptive Immunität verbessern kann.
Darüber hinaus wurden auch immunverwandte Zytokine im Serum untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass das LVFP die IL-10- und TNF-α-Spiegel erhöhte. Berichten zufolge können verschiedene Arten von Polysacchariden die Expression von Entzündungsfaktoren beeinflussen. In: Chen et al. beobachtet, dass sulfatierte Polysaccharide aus filamentösen Mikroalgen Tribonema sp. kann IL-6, IL-10 und TNF-α Ausdrücke in den Makrophagen erhöhen. In: Cheng et al. berichtet, dass Polysaccharide aus dem wilden Lactarius deliciosus die Sekretion von TNF-α, IL-1β und IL-6 in Makrophagen erhöhten . In: Wang et al. berichtet, dass das Polysaccharid aus der Flechte Umbilicaria esculenta die Freisetzung von TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6 und IL-10 in murinen Makrophagen induzierte .
Antioxidantien sind Substanzen, die die Oxidation im menschlichen Körper unterdrücken. Normalerweise besteht ein Gleichgewicht zwischen der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und dem antioxidativen Abwehrsystem, das für den normalen Stoffwechsel unverzichtbar ist. Zellen produzieren einige endogene Antioxidantien wie SOD und GSH-px, um übermäßige freie Radikale zu unterdrücken . Diese Studie bestimmte die antioxidative Aktivität des LVFP in Cy-induzierten immunsuppressiven Mäusen. Die Ergebnisse zeigten, dass das LVFP einen signifikanten Anstieg der SOD- und GSH-px-Expression aufwies. Darüber hinaus verringerte das LVFP die MDA-Expression, was auf oxidative Schäden in der Leber hinweist. ER wies auch darauf hin, dass das LVFP Leberzellschäden lindern kann, die durch Cy induziert werden. Daraus kann geschlossen werden, dass das LVFP Zellen vor oxidativem Stress-induzierten Schäden schützen könnte, indem es die Produktion von Antioxidantien wie SOD und GSH-px erhöht. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der Gehalt an Rhamnose, Arabinose und Galactose in der Monosaccharidzusammensetzung die antioxidative Aktivität beeinflussen kann . Der Gehalt an Rhamnose, Arabinose und Galactose im LVFP ist höher, was für die stärkere antioxidative Aktivität des LVFP wichtig sein kann.
Insgesamt wurden Polysaccharide aus der Ligustrum vicaryi L. Frucht extrahiert und ihre physikalischen und biologischen Eigenschaften untersucht. Das LVFP könnte als potenzielles immunmodulatorisches und antioxidatives Mittel zur therapeutischen Verwendung bei immunsuppressiven Erkrankungen untersucht werden, was die Einführung der traditionellen chinesischen Medizin auf dem internationalen Markt ermöglicht.
5. Schlussfolgerungen
Abschließend wurde das LVFP aus der Ligustrum vicaryi L.-Frucht mit einem Molekulargewicht von 88.949 Da extrahiert und gereinigt und bestand aus vier Monosacchariden, nämlich Rhamnose, Arabinose, Galactose und Glucose. Vorläufige pharmakologische Studien zeigten, dass das LVFP die Immunfunktionen effektiv verbessern konnte und antioxidative Aktivität aufwies. Diese Studie zeigt, dass das LVFP ein vielversprechendes immunmodulatorisches und antioxidatives Mittel für pharmazeutische Therapien sein kann (Abbildung 7).
Datenverfügbarkeit
Die TIF-Daten, die zur Unterstützung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte in Bezug auf die Veröffentlichung dieses Artikels bestehen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81800399), dem Jining Medical University Doctoral Research Startup Fund, dem Fund for National-Level College Students‘ Innovation and Entrepreneurship Training Project (201610443011), dem Shandong Traditional Chinese Medicine Science and Technology Development Program (2019-0450) und dem Jining Medical University Student Innovation Training Program ( cx2016011/cx2019092).