c-Methylierungsmittel
Die Kreuzempfindlichkeit bestimmter Bakterienstämme gegenüber UV-Bestrahlung und dem monofunktionellen Alkylierungsmittel MMS scheint im Gegensatz zu den bisher diskutierten Verbindungen nicht auf eine ähnliche Erkennung exzisionsfähiger Schäden durch dieselbe Endonuklease zurückzuführen zu sein, die Thymindimere in der DNA erkennt. Die Existenz von bakteriellen Mutanten, die gegenüber MMS empfindlich sind, ist ein Anscheinsbeweis für die Existenz von Reparaturmechanismen im Wildtyp, aber es scheint nun, dass es nicht eine alkylierte Base an sich ist, die durch einen Reparaturmechanismus erkannt wird, sondern wahrscheinlich ein Einzelstrangbruch in der DNA. Nach der MMS-Behandlung wurde B. subtilis durch die Bildung von Einzelstrangbrüchen in der DNA inaktiviert, was, wie gezeigt wurde, Wildtyp B. subtilis reparieren kann (Strauss und Wahl, 1964; Prakash und Strauss, 1970); Eine MMS-empfindliche Mutante war jedoch in dieser Fähigkeit mangelhaft oder mangelhaft. Darüber hinaus wurde argumentiert, dass die beobachtete Kreuzempfindlichkeit gegenüber UV- oder Röntgenstrahlen durch die Bildung von Einzelstrangbrüchen erklärt werden könnte, von denen bekannt ist, dass sie durch diese letzteren Mittel gebildet werden.
Die Bestätigung dieses Gesichtspunkts wurde durch die Eigenschaften einer B. subtilis-Mutante erhalten, die gegenüber UV-Bestrahlung, aber nicht gegenüber MMS empfindlich war (Searashi und Strauss, 1965). Diese Methylierung von DNA-Basen, eher als MMS-induzierte Strangbrüche, ruft keine Exzisionsreparatur in B hervor. subtilis zeigte sich auch deutlich darin, dass während mehrerer Zellgenerationen kein signifikanter Verlust von Methylgruppen aus DNA von Wildtyp- oder sensitiven Zellen beobachtet wurde. Dieser Befund zeigte die Fähigkeit von Zellen, methylierte DNA zu replizieren, und steht im Einklang mit der replikativen Kapazität von DNA, die durch Arylalkylierung modifiziert wurde (Venitt und Tarmy, 1972).
Die obige Studie über die Reparatur von MMS-induzierten Methylierungsschäden in B. subtilis kann daher anderen Studien zur Reparatur von Alkylierungsschäden gegenübergestellt werden, die durch das monofunktionelle Methylierungsmittel MNNG (Lawley und Orr, 1970) in E. coli B / r. Es unterscheidet sich von MMS darin, dass es einen deutlich höheren Anteil an O 6-Methylguaninresten in alkylierter DNA erzeugt. Dieses Produkt sowie 3-Methyladenin und möglicherweise einige nicht identifizierte Produkte (Ursprungsmaterial auf Papierchromatogrammen) scheinen selektiv ausgeschnitten zu werden, verglichen mit dem Verlust von N −7-Methylguanin aus der DNA von E. coli B / r-Zellen unter Bedingungen, die sowohl Wachstum als auch DNA-Synthese ermöglichen. 3-Methyladenin und O 6-Methylguanin, jedoch nicht das Ausgangsmaterial, wurden ebenfalls aus Bs–1-Zellen herausgeschnitten, möglicherweise jedoch mit reduzierter Rate. Es wurde von Lawley und Orr nicht angegeben, ob es einen Unterschied im Überleben von MNNG-behandelten B / r– und Bs-1-Zellen gab oder nicht, was darauf hindeuten könnte, dass solche Unterschiede in der Exzisionskapazität den Betrieb eines DNA-Reparaturmechanismus widerspiegeln, der das Überleben der Zellen unterstützt. Kondo et al. (1970) berichteten über keine erhöhte Letalität oder erhöhte Mutationshäufigkeit in E. coli für Stämme, die nicht in der Lage waren, Pyrimidindimere nach Behandlung mit MNNG im Vergleich zu MMS zu entfernen. Dies trotz der Tatsache, dass die Alkylierung von DNA durch MNNG die 20-fache Menge an O 6-Methylguanin erzeugt als die Alkylierung von DNA durch MMS (Lawley et al., 1971–1972).
Der Nachweis, dass dieser „Verlust“ von 3-Methyladenin und O 6-Methylguanin durch einen enzymatischen Exzisionsmechanismus vermittelt wird, der sich von einer UV-Endonuklease unterscheidet, stammt aus In-vitro-Studien über die Eigenschaften eines Enzyms, das als Endonuklease II bezeichnet wird und aus E. coli isoliert wurde (Friedberg und Goldthwait, 1969). Dieses Enzym ist in der Lage, Phosphodiesterbindungen in DNA, die mit dem Alkylierungsmittel MMS umgesetzt wurde, aufzubrechen und depurinierte Stellen in DNA zu erkennen. In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass es O 6-Methylguanin und N 3-Methyladenin, aber nicht N 7-Methylguanin aus DNA freisetzt, die durch das Karzinogen MNU methyliert wurde (Kirtikar und Goldthwait, 1974). Die Endonuklease II besitzt daher eindeutig viele verschiedene Funktionen, von denen eine in der Lage zu sein scheint, glykosidische Bindungen zu lösen, die an bestimmte substituierte Purine gebunden sind. Andererseits könnte es sich möglicherweise um eine Mischung von Enzymen handeln. Die Existenz eines Enzyms, das in ähnlicher Weise in der Lage ist, diese postulierte Spaltung von N-glykosidischen Bindungen durchzuführen (und daher als N-Glykosidase bezeichnet wird), wurde kürzlich aus E. coli isoliert und es wurde gezeigt, dass es freies Uracil aus DNA-haltigen desaminierten Cytosinresten freisetzt (Lindahl, 1974). Die resultierende depurinierte Stelle kann dann von einem anderen assoziierten Enzymsystem erkannt und repariert werden (vgl. Verly und Paquette, 1972). Spezifität einer E. coli-Präparation wurde auch für 3-Alkyladenin beobachtet, jedoch nicht für 7-Alkyladenin von Papirmeister et al. (1970). Es wurde festgestellt, dass 3-Ethyladenin und O 6−Ethylguanin, jedoch keine N-7-Ethylguaninreste in DNA, die durch Reaktion von N-Ethyl-N-Nitrosoharnstoff gebildet wurden, in ähnlicher Weise aus E. coli WP2-DNA herausgeschnitten werden (Lawley und Warren, 1975). Die Exzision der Nebenprodukte der Purinalkylierung wurde nun in Säugetierzellen in vivo beobachtet, und darüber hinaus wurde eine verminderte Exzisionskapazität in bestimmten Geweben mit der Identität des Zielorgans für einige alkylierende Karzinogene korreliert (siehe späterer Abschnitt I, C von Teil B).
Der offensichtliche Mangel an Erkennung und Exzision von N 7-Alkylguaninresten in DNA durch einen Reparaturmechanismus, wie er in den Studien von Prakash und Strauss (1970) und von Lawley und Orr (1970) angegeben ist, war auch in Studien von Kimball et al. (1971a) über die Wirkung von MMS und MNNG bei Haemophilus influenzae. Es ist daher etwas überraschend, dass derselbe Rückstand in Euglena gracilis erkannt zu werden scheint. Nach der Methylierung mit N-Methyl-N-nitroso-p-toluolsulfonat ging 7-methylguanin mit einer Halbwertszeit von 10 h (Olson und McCalla, 1969), die deutlich kürzer ist als die Halbwertszeit von ca. 5 Tagen für die spontane Hydrolyse bei pH 7,4 in Citronensäure-phosphat-Puffer (Margison et al., 1973). Darüber hinaus exzidierte ein resistenter Mutantenstamm das N −7-Methylguanin offenbar schneller als der empfindliche Stamm mit dem Auftreten von Mononukleotiden aus abgebauter DNA im Zellüberstand (Olson und McCalla, 1969). Dieser unerwartete Befund verdient daher weitere Untersuchungen. Diese Ergebnisse, dann, zusammen mit dem leichten Hinweis auf einen schnelleren Verlust von 7-Methylguanin aus Rattenleber-DNA in vivo von Margison et al. (1973), aber nicht von Craddock (1973a), könnte darauf hindeuten, dass dieser DNA-Substituent unter bestimmten Umständen von einem Reparaturenzym erkannt werden kann.
Tabelle VI fasst die vorstehenden Beispiele für den Verlust chemischer Produkte aus bakterieller DNA zusammen.