Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-SEITE): Fortschritte und Perspektiven

Einleitung

In den letzten 25 Jahren und insbesondere im letzten Jahrzehnt wurden verstärkte Anstrengungen unternommen, um Technologien zu entwickeln, mit denen eine große Anzahl von Proteinen identifiziert und quantifiziert werden kann, die in einem Zellsystem (d. H. Dem Proteom) exprimiert werden, um beispielsweise Krankheitsbiomarker zu erkennen, Proteinschaltungen abzubilden oder neuartige Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Die Komplexität des Proteoms hat die Entwicklung von Methoden zur effizienten Trennung und zum sensitiven Nachweis von Proteinen zu einem kritischen Bestandteil dieser Bemühungen gemacht. Kontinuierliche Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) -Technologie haben den Nachweis von Proteinen mit viel größerer Geschwindigkeit und Empfindlichkeit ermöglicht als bisher möglich. Selbst modernste MS ist jedoch nicht in der Lage, alle Komponenten innerhalb eines komplexen Proteoms zu charakterisieren. Wissenschaftler verfolgen einen „Divide and Conquer“ -Ansatz zur Charakterisierung von Proteomen, indem sie versuchen, die Anzahl der Proteine, die das Massenspektrometer analysieren soll, zeitlich zu begrenzen. Durch das Ausbreiten des Proteoms werden letztendlich mehr Proteine innerhalb eines einzelnen Experiments analysiert.

Um Proteome zu trennen, haben Wissenschaftler elektrophoretische und chromatographische Technologien separat und in Kombination sowie offline und online verwendet. Obwohl diese Bemühungen zur Trennung und Identifizierung von Tausenden von Proteinen führen können, kann keine einzige Methode aufgrund ihrer großen Anzahl und Konzentrationsdynamik alle Proteine in einem Proteom auflösen. Eindimensionale Trennungen reichen nicht aus, um komplexe Proteingemische effektiv aufzulösen. Diese Tatsache wurde vor über einem halben Jahrhundert von Smithies und Poulik (1) anerkannt, die erkannten, dass eine Kombination von zwei elektrophoretischen Prozessen auf einem Gel im rechten Winkel einen viel größeren Auflösungsgrad ergeben sollte, als dies mit beiden separat möglich ist. Die beiden elektrophoretischen Verfahren werden durch Molekülgröße und freie Lösungsmobilität auf einem Stärkegel bestimmt. Ihre Vorhersage hat sich weiterhin als wahr erwiesen und bildete die Grundlage für die Entwicklung orthogonaler mehrdimensionaler Methoden zur Trennung komplexer Gemische nicht nur durch Gelelektrophorese, sondern auch durch Chromatographie und Kapillarelektrophorese.

Um die Fortschritte bei der zweidimensionalen SEITE (2D-SEITE) richtig zu verstehen, muss man viel weiter als ein Vierteljahrhundert zurückgehen. 1930 führte Tiselius die Moving-Boundary-Methode als analytisches Werkzeug zur Untersuchung der Elektrophorese von Proteinen ein (2). Seit seiner Pionierarbeit werden verschiedene Formen der Elektrophorese zur Trennung komplexer Proteingemische mit jeweils verbesserter Auflösung eingesetzt. Bereits 1962 demonstrierten Raymond und Aurell (3) die signifikanten nichtlinearen Effekte der Gelkonzentration auf die elektrophoretische Mobilität von Proteinen, indem sie 2-D-Elektrophorese unter Verwendung verschiedener Acrylamid-Gelkonzentrationen zur Trennung von Serumproteinen einsetzten. Zwei Jahre später demonstrierte Raymond (4) die Überlegenheit von Gelen mit flachen Platten im Vergleich zu Gelen mit zylindrischen Rohren. Zum Beispiel bietet die flache Platte eine maximale Oberfläche zum Abkühlen des Gels; Die resultierenden Muster sind in Standard-Aufzeichnungsdensitometern leichter zu quantifizieren; eine große Anzahl von Proben kann mit einer einzigen Gelplatte verarbeitet werden, was den direkten Vergleich von Proben erleichtert, die unter identischen Bedingungen verarbeitet wurden; und vor allem ermöglicht die flache Platte die Anwendung von 2-D-Separationen. Diese aufschlussreichen Präferenzen haben sich als wahr erwiesen und werden heute in vielen bioanalytischen Labors praktiziert.

Ein weiterer Fortschritt bei der 2D-Gelseparation wurde 1972 von Wright (5) eingeführt, der in der ersten Dimension eine 4,75% ige (2% vernetzte) Polyacrylamid-Gelsäule verwendete, die dann aus dem Glaszylinder entnommen und auf den oberen Rand einer 2% igen Gradientenplatte gelegt wurde. Nach der Elektrophorese wurde die Gelplatte in eine Färbelösung gegeben, was zur Visualisierung von 112 aufgelösten humanen Serumproteinen führte.

Diese neuartigen Ansätze lösten nur eine kleine Anzahl von Proteinen, hauptsächlich die am häufigsten vorkommenden Proteine einer Zelle oder eines Serumproteins. Die Einführung von 2D-PAGE im Jahr 1975 durch O’Farrell (6) zur Trennung zellulärer Proteine unter denaturierenden Bedingungen ermöglichte die Auflösung von Hunderten von Proteinen. Das angewandte Prinzip war sehr einfach: proteine wurden auf einem Gel unter Verwendung der isoelektrischen Fokussierung (IEF) aufgelöst, die Proteine in der ersten Dimension nach ihrem isoelektrischen Punkt trennt, gefolgt von einer Elektrophorese in einer zweiten Dimension in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS), das Proteine nach ihrer Molekülmasse trennt. O’Farrells Methode ist wirklich die Grundlage der modernen 2D-SEITE, die schnell angepasst und von anderen Forschern weithin akzeptiert wurde. Anderson und Anderson (7) verwendeten 2D-PAGE für die Analyse von humanen Plasmaproteinen. Sie waren in der Lage, etwa 300 verschiedene Proteinflecken beim Färben zu trennen und nachzuweisen. Im Gegensatz zu O’Farrell trennte Manabe (8) menschliche Plasmaproteine unter Verwendung von 2D-PAGE ohne Denaturierungsmittel. Etwa 230 Proteinflecken konnten auf dem Gel beobachtet werden; Die Flecken waren jedoch verschmiert und nicht gut aufgelöst.

Einführung immobilisierter pH-Gradienten

Wie oben erwähnt, umfasst 2D-PAGE IEF in der ersten Dimension, gefolgt von SDS-PAGE in der zweiten Dimension. Seit seiner Einführung durch Kolin im Jahr 1954 (9) hat IEF mehrere Fortschritte gemacht. Die erste Dimension wird in Polyacrylamid-Gelstäben durchgeführt, die in Glas- oder Kunststoffröhrchen gebildet sind und Ampholyte enthalten, die in einem elektrischen Feld einen pH-Gradienten bilden. Diese Stäbe waren historisch nicht reproduzierbar, instabil und schwer zu bearbeiten. Die Einführung immobilisierter pH-Gradienten (IPGs) durch Bjellqvist et al. (10) hatten einen signifikanten Einfluss auf die Verwendung von IEF zur Trennung komplexer Gemische über einen weiten pH-Bereich. Die IPGs ermöglichten die Bildung stabiler und reproduzierbarer pH-Gradienten, die saure und basische Proteine auf ein einzelnes Gel fokussieren können, das mit breiten pH-Gradienten hergestellt wurde. In IPGs werden die Trägerampholyte an Acrylamidmoleküle gebunden und in die Gele gegossen, um einen festen pH-Gradienten zu bilden. Die Fixierung des Gradienten verhindert das Driften im Gel und stellt außerdem sicher, dass sie effizient und reproduzierbar gegossen werden können. Durch die Verwendung von IPG-Streifen mit schmalem Bereich konnte eine größere Anzahl von Proteinen getrennt werden, als dies mit Standard-2D-PAGE möglich war, da ein engerer pH-Bereich über eine größere physikalische Entfernung verteilt war. Diese Ausbreitung ermöglichte es, Proteine mit ähnlichen isoelektrischen Punktwerten (pI) mit höherer Auflösung zu trennen. Um diesen Punkt zu veranschaulichen, Hoving et al. entwickelte eine 2D-PAGE-Methode, bei der sie schmalbandige IPG-Streifen in der ersten Dimension aufbrachten (11). Die IPG-Streifen waren typischerweise 1-3 pH U breit und überlappten sich um mindestens 0,5 pH U. Es wurden sechs IPG-Streifen verwendet, die den pH-Bereich von 3,5 bis 10 abdeckten. Proteine aus einer B-Lymphom-Zelllinie wurden auf jeden Streifen aufgebracht und mit IEF getrennt. Jeder Streifen wurde dann auf eine einzelne SDS-PAGE-Gelplatte aufgebracht und Proteine wurden in der zweiten Dimension basierend auf ihrem Molekulargewicht getrennt. Unter Verwendung der sechs IPG-Streifen wurden ungefähr 5000 verschiedene Flecken nachgewiesen, verglichen mit 1500 Flecken, die unter Verwendung eines einzelnen IPG-Streifens mit einem pH-Bereich von 3-10 und einer einzelnen Standard-2D-PAGE-Gelplatte nachgewiesen wurden. Wildgruber et al. (12) verglich die Verwendung von 3 IPG–Streifen mit pH-Bereichen von 4-5, 5-6 und 5,5-6,7 mit Gelen, die mit IPG-Streifen mit pH-Gradientenbereichen von 3-10 und 4-7 durchgeführt wurden. Sie waren in der Lage zu erkennen, 2.3 und 1.6× mehr protein-spots mit drei narrow-range-IPG-Streifen als mit den beiden breiteren narrow-range-IPG-Streifen (3-10 und 4-7), beziehungsweise.

Während die höhere Auflösung, die mit mehreren überlappenden schmalen IPGs erreicht werden kann, die Identifizierung von mehr Proteinen ermöglicht, erfordert jeder schmale Streifen eine separate Gelplatte und eine bestimmte Menge derselben Probe, die auf jede geladen werden muss. Diese Anforderung bedeutet, dass ein solches Experiment möglicherweise nicht möglich ist, wenn das Probenvolumen oder die Konzentration begrenzt ist. Bei begrenzten Proben sollte ein breiterer pH-Bereich oder eine Mindestanzahl von IPGs in Betracht gezogen werden.

Zweidimensionale differentielle In-Gel-Elektrophorese (2D-DIGE)

Das Ziel der Trennung von Proteinen mittels 2D-PAGE ist zweifach: (i) Identifizierung neuer Proteine und (ii) Messung ihrer relativen Häufigkeit zwischen Vergleichsproben. Ein Vorteil der 2D-PAGE als Trenntechnik ist, dass sie nicht nur eine große Anzahl von Proteinen auflöst, sondern durch die Färbung dieser Proteine auch die relative Häufigkeit der Proteine quantifiziert werden kann. Beispielsweise werden Proteine, die aus zwei Serumproben (gesund und krank) extrahiert wurden, jeweils auf eine separate Gelplatte geladen. Nach der Färbung werden die Proteinflecken ausgerichtet und gescannt, um ihre individuellen Intensitäten zu messen. Während viele Fortschritte bei den Software-Ausrichtungswerkzeugen erzielt wurden, war es eine Herausforderung, einen direkten Punkt-zu-Punkt-Vergleich zwischen zwei separaten Gelen sicherzustellen. Die Entwicklung der 2D-Differential-In-Gel-Elektrophorese (DIGE) im Jahr 1997 überwand diese Einschränkung, indem bis zu drei verschiedene Proteingemische innerhalb eines einzigen 2D-PAGE-Gels getrennt werden konnten (13). In einem typischen 2D-DIGE-Experiment werden Proteine, die aus drei verschiedenen Proben extrahiert wurden, gesund, krank und interne Kontrolle (eine gepoolte Probe, die aus dem Mischen gleicher Mengen der aus den gesunden und kranken Proben extrahierten Proteine gebildet wird), kovalent markiert jeweils mit einem Cyanin-Fluoreszenzfarbstoff, der eine unterschiedliche Anregungs- und Emissionswellenlänge aufweist. Die Proben werden migrationsmäßig aufeinander abgestimmt, so dass dasselbe Protein, das mit einem der Farbstoffe markiert ist, an dieselbe Position auf dem Gel migriert. Die verwendeten Cyaninfarbstoffe sind: 1-(5-carboxy-pentyl)-1′-propylindocarbacyaninhalogenid-N-hydroxysuccinimidylester (Cy3); 1-(5-carboxypentyl) -1′-methylindodicar-bacyaninhalogenid-N-hydroxysuccinimidylester (Cy5); und 3-(4-Carboxymethyl) phenylmethyl-3′-ethyloxacarbacyaninhalogenid-N-Hydroxysuccinimidylester (cy2). Gleiche Konzentrationen der unterschiedlich markierten Proteine und der Kontrollprobe werden gemischt, auf eine einzige Gelplatte aufgebracht und mittels 2D-PAGE getrennt. Die Kontrollprobe dient als interner Standard, der sowohl Inter- als auch Intra-Gel-Matching ermöglicht. Die Kontrollprobe sollte jedes Protein enthalten, das in allen Proben eines Experiments vorhanden ist. Dies bedeutet, dass jedes Protein im Experiment ein eindeutiges Signal im internen Standard hat, das für direkte quantitative Vergleiche innerhalb jedes Gels und zur Normalisierung der quantitativen Abundanzwerte für jedes Protein zwischen Gelen verwendet wird. Das Scannen des Gels bei den spezifischen Anregungswellenlängen jedes Farbstoffs mit einem Fluoreszenz-Imager ermöglicht die Visualisierung der differentiell markierten Proteine (Abbildung 1). Die Bilder werden dann mit einer Bildgebungssoftware zusammengeführt und analysiert, wodurch Unterschiede zwischen den Abundanzniveaus von Proteinen verglichen werden können. Der Wert in DIGE eliminiert jeden Fehler im Zusammenhang mit der Fehlausrichtung des Gels und gewährleistet eine genaue Quantifizierung (14).

Proteine von Interesse werden aus dem Gel herausgeschnitten, proteolytisch verdaut und mit MS identifiziert. Da es mit einer einzigen Gelplatte durchgeführt wird, benötigt 2D-DIGE 50% weniger Gele, was es wirtschaftlicher macht und Unterschiede in der Proteinexpression zwischen zwei verschiedenen Proteinproben einfacher zu vergleichen und genauer abzubilden. Darüber hinaus ist weniger Zeit erforderlich, um die Proteinflecken nachzuweisen, da die Markierungsreaktion in DIGE schneller ist als die Visualisierung mit Färbemethoden. Wenn es notwendig ist, die Proteinexpressionsniveaus von zwei verschiedenen Proben zu vergleichen, ist DIGE die Methode der Wahl (15).

Stärken und Schwächen der 2D-SEITE

Die Elektrophorese ist eine etablierte Technik, die mehrere Fortschritte erfahren hat, die die Auflösung, Erkennung, Quantifizierung und Reproduzierbarkeit verbessert haben. Die 2D-SDS-PAGE- und 2D-DIGE-Ansätze zur Proteinprofilierung sind zugängliche und kostengünstige Methoden, die ein hohes Auflösungsvermögen besitzen und den Nachweis von Hunderten von Proteinen auf einer einzigen Gelplatte ermöglichen. Obwohl die Reproduzierbarkeit bei 2D-PAGE ein Problem darstellt, insbesondere bei der Profilierung von zwei Proteingemischen, wurde sie durch die Verwendung von 2D-DIGE erheblich verbessert. Die Auflösung wurde durch die Einführung von IPGs verbessert, die es dem Analytiker ermöglichen, den pH-Gradienten für maximale Auflösung mit Ultrazoom-Gelen mit einem engen pH-Gradientenbereich anzupassen. Mit moderner 2D-PAGE ist es nicht ungewöhnlich, zwei Proteine aufzulösen, die sich in pI um 0,001 U unterscheiden.

Obwohl 2D-PAGE durch seine Unfähigkeit eingeschränkt wurde, Proteine aufzulösen, die zu basisch oder zu sauer, zu groß oder zu klein sind, nimmt diese Einschränkung kontinuierlich ab. Beispielsweise kann die Trennung von basischen Proteinen mit IPGs im pH-Bereich von 4-12 analysiert werden. Die Trennungswissenschaft entwickelt sich ständig weiter und es wird nicht lange dauern, bis die verbleibenden Probleme der Gelelektrophorese angemessen gelöst sind.

Die Einführung von 2D-DIGE trug immens zur Lösung von Reproduzierbarkeits- und Quantifizierungsproblemen bei. Der Einsatz von Imagern und Computern ermöglicht nicht nur schnelles Data Mining, Erfassung und Analyse, sondern auch Spoterkennung, Normalisierung, Proteinprofilierung, Hintergrundkorrektur sowie Reporting und Export von Daten. Als Trenn-, Nachweis- und Quantifizierungstechnik ist 2D-DIGE ein wichtiges Instrument, insbesondere für klinische Labors, die an der Bestimmung von Proteinexpressionsniveaus und der Entdeckung von Krankheitsbiomarkern beteiligt sind. Wenn die absolute biologische Variation zwischen Proben das Hauptziel ist, wie bei der Entdeckung von Biomarkern, ist 2D-DIGE die Methode der Wahl.

Während es signifikante Fortschritte bei Nicht-Gel- (oder lösungsbasierten) Methoden zur Kopplung von Fraktionierungsmethoden direkt online mit der MS-Analyse gab, ist 2D-PAGE eine beliebte Technik zur Durchführung proteomischer Studien geblieben. Obwohl 2D-PAGE, wie jedes Fraktionierungsschema, seine Vor- und Nachteile hat, besteht kein Zweifel, dass es für viele Jahre eine wesentliche Technik für die Charakterisierung von Proteomen bleiben wird.