Kaksiulotteinen polyakryyliamidigeelielektroforeesi (2D-sivu): advances and perspectives

Introduction

viimeisten 25 vuoden ja erityisesti viime vuosikymmenen aikana on nähty entistä enemmän pyrkimyksiä kehittää teknologioita, joilla voidaan tunnistaa ja kvantifioida suuria määriä solujärjestelmässä (eli proteomissa) esiintyviä proteiineja siinä toivossa, että voidaan havaita taudin biomarkkerit, kartoittaa proteiinipiirejä tai tunnistaa uusia fosforylaatiopaikkoja, esimerkiksi. Proteomin monimutkaisuus on tehnyt tehokkaaseen proteiinien erotteluun ja herkkään havaitsemiseen tarkoitettujen menetelmien kehittämisestä ratkaisevan osan tässä pyrkimyksessä. Massaspektrometrian (MS) tekniikan jatkuva kehitys on mahdollistanut proteiinien havaitsemisen paljon nopeammin ja herkemmin kuin aiemmin on ollut mahdollista. Edes huippuluokan MS ei kuitenkaan pysty luonnehtimaan kaikkia kompleksisen proteomin komponentteja. Tiedemiehet suhtautuvat” hajota ja hallitse ” – lähestymistapaan luonnehtiessaan proteomeja, sillä he yrittävät tilapäisesti rajoittaa niiden proteiinien määrää, joita massaspektrometriä pyydetään analysoimaan. Levittämällä proteomi, enemmän proteiineja lopulta analysoidaan sisällä yksittäisen kokeen.

proteomien erottamiseksi tutkijat ovat käyttäneet elektroforeettista ja kromatografista teknologiaa erikseen ja yhdessä sekä offline-että online-tilassa. Vaikka nämä ponnistelut voivat johtaa tuhansien proteiinien erottamiseen ja tunnistamiseen, mikään yksittäinen menetelmä ei voi ratkaista kaikkia proteomin proteiineja niiden suuren lukumäärän ja konsentraation dynaamisen alueen vuoksi. Yksiulotteiset erotukset eivät riitä monimutkaisten proteiiniseosten tehokkaaseen erottamiseen. Tämä tosiasia tunnustettiin yli puoli vuosisataa sitten Smithies ja Poulik (1), jotka tunnustivat, että yhdistelmä kahden elektroforeettisia prosesseja geeli suorassa kulmassa pitäisi antaa paljon suurempi resoluutio kuin on mahdollista joko erikseen. Kaksi elektroforeettista prosessia ovat resoluutiota molekyylikoolla ja vapaan liuoksen liikkuvuudella tärkkelysgeelillä. Niiden ennustus on edelleen osoittautunut todeksi, ja se on luonut perustan ortogonaalisten moniulotteisten menetelmien kehittämiselle monimutkaisten seosten erottamiseksi geelielektroforeesin lisäksi myös kromatografian ja kapillaarielektroforeesin avulla.

jotta kaksiulotteisella sivulla (2D-sivulla) saavutetut edistysaskeleet ymmärrettäisiin kunnolla, on mentävä paljon kauemmas kuin neljännesvuosisata. Tiselius esitteli vuonna 1930 moving boundary-menetelmän analyyttisenä työkaluna proteiinien elektroforeesin (2) tutkimiseen. Hänen uraauurtavasta työstään lähtien monimutkaisten proteiiniseosten erottamiseen on käytetty erilaisia elektroforeesimuotoja, joista jokaisella on parempi resoluutio. Jo vuonna 1962 Raymond ja Aurell (3) osoittivat geelikonsentraation merkittävät epälineaariset vaikutukset proteiinien elektroforeettiseen liikkuvuuteen käyttämällä 2-D-elektroforeesia eri akryyliamidigeelipitoisuuksilla seerumin proteiinien erottamiseksi toisistaan. Kaksi vuotta myöhemmin Raymond (4) osoitti tasolaattageelien ylivertaisuuden lieriömäisiin putkigeeleihin verrattuna. Esimerkiksi tasainen laatta tarjoaa maksimaalisen pinta-alan geelin jäähdytykseen; tuloksena olevat kuviot on helpompi määrittää vakiotallennustiheysmittareissa; suuri määrä näytteitä voidaan käsitellä yhdellä geelilevyllä, mikä helpottaa samanlaisissa olosuhteissa käsiteltyjen näytteiden suoraa vertailua; ja mikä tärkeintä, litteä laatta mahdollistaa 2-D-erotusten soveltamisen. Nämä oivaltavat mieltymykset ovat osoittautuneet todeksi, ja niitä harjoitetaan nykyään monissa bioanalyyttisissä laboratorioissa.

toinen edistysaskel 2-D-geelierotuksessa otettiin käyttöön vuonna 1972 Wright (5), joka käytti ensimmäisessä ulottuvuudessa 4,75%: n (2%: n ristisiteen) polyakryyliamidigeelikolonnia, joka sitten irrotettiin lasisylinteristä ja asetettiin 2%: n gradienttilaatan yläreunaan. Elektroforeesin jälkeen geelilaatta laitettiin värjäysliuokseen, jolloin saatiin visualisoitua 112 ihmisen seerumiproteiinia.

nämä uudet lähestymistavat ratkaisivat vain pienen määrän proteiineja, pääasiassa solun tai seerumin proteomin runsaimpia proteiineja. O ’ Farrellin vuonna 1975 esittelemä 2D-sivu (6) soluproteiinien erottamiseksi denaturointiolosuhteissa mahdollisti satojen proteiinien erottelun. Sovellettu periaate oli hyvin yksinkertainen: proteiinit ratkaistiin geelillä käyttäen isoelektristä tarkennusta (IEF), joka erottaa proteiinit ensimmäisessä ulottuvuudessa niiden isoelektrisen pisteen mukaan, minkä jälkeen elektroforeesi toisessa ulottuvuudessa natriumdodekyylisulfaatin (SDS) läsnä ollessa, joka erottaa proteiinit niiden molekyylimassan mukaan. O ’ Farrellin menetelmä on todella nykyaikaisen 2D-sivun perusta, jota muut tutkijat nopeasti muokkasivat ja laajalti hyväksyivät. Anderson ja Anderson (7) käyttivät 2D-sivua ihmisen plasmaproteiinien analysointiin. Ne pystyivät erottamaan ja havaitsemaan värjäyksen yhteydessä noin 300 erillistä proteiiniläiskää. Toisin kuin O ’ Farrell, Manabe (8) erotteli ihmisen plasman proteiineja käyttämällä 2D-Pagea ilman denaturointiaineita. Geelissä voitiin havaita noin 230 proteiiniläiskää; täplät olivat kuitenkin tahriintuneet eivätkä selvinneet hyvin.

immobilisoitujen pH-gradienttien käyttöönotto

kuten edellä mainittiin, 2D-sivu käsittää IEF: n ensimmäisessä ulottuvuudessa ja SDS-sivun toisessa ulottuvuudessa. Sen jälkeen, kun Kolin otti IEF: n käyttöön vuonna 1954 (9), se on kokenut useita edistysaskeleita. Ensimmäinen ulottuvuus suoritetaan lasi-tai muoviputkiin muodostuvissa polyakryyliamidigeelitangoissa, jotka sisältävät amfolyyttejä, jotka muodostavat sähkökentässä pH-gradientin. Nämä sauvat olivat historiallisesti korjaamattomia, epävakaita ja vaikeasti työstettäviä. Bjellqvist et al.: n immobilisoitujen pH-gradienttien (IPGs) käyttöönotto. (10) vaikutti merkittävästi IEF: n käyttöön monimutkaisten seosten erottelussa laajalla pH-alueella. IPG: t mahdollistivat vakaiden ja toistettavissa olevien pH-gradienttien muodostumisen, jotka pystyivät keskittämään happamat ja emäksiset proteiinit yhteen geeliin, joka oli valmistettu laajoilla pH-gradienteilla. IPG-geeleissä kantajaampholyytit kiinnitetään akryyliamidimolekyyleihin ja valetaan geeleihin kiinteän pH-gradientin muodostamiseksi. Gradientin kiinnittäminen estää geelin kulkeutumisen ja varmistaa myös, että ne voidaan valaa tehokkaasti ja toistettavissa olevalla tavalla. Kapeahkojen IPG-liuskojen avulla voitiin erottaa suurempi määrä proteiineja kuin normaalilla 2D-sivulla oli ollut mahdollista, koska kapeampi pH-alue oli levittäytynyt suuremmalle fysikaaliselle etäisyydelle. Tämä leviäminen mahdollisti samankaltaisten isoelektristen pisteen (pI) arvojen proteiinien erottamisen suuremmalla resoluutiolla. Tämän havainnollistamiseksi Hoving et al. he kehittivät 2D-sivuisen menetelmän, jossa he soveltivat kapeakantaisia IPG-liuskoja ensimmäisessä ulottuvuudessa (11). IPG-liuskat olivat tyypillisesti 1-3 pH U leveitä ja päällekkäin vähintään 0,5 pH U. käytettiin kuutta IPG-liuskaa, jotka kattoivat pH-alueen 3,5 – 10. B-lymfooman solulinjan proteiinit levitettiin jokaiseen kaistaleeseen ja eroteltiin IEF: n avulla. Jokainen liuska levitettiin sitten yksittäiselle SDS-SIVUISELLE geelilevylle ja proteiinit erotettiin toisessa ulottuvuudessa niiden molekyylipainon perusteella. Noin 5000 erillistä täplää havaittiin kuuden IPG-liuskan avulla, kun taas 1500 täplää havaittiin yhdellä IPG-liuskalla, jonka pH-alue oli 3-10 ja yhdellä standardoidulla 2D-sivuisella geelilevyllä. Wildgruber ym. (12) verrattiin 3 IPG–liuskan käyttöä pH-alueilla 4-5, 5-6 ja 5.5-6.7 geeleihin, joissa käytetään IPG-liuskoja, joiden pH-kaltevuus on 3-10 ja 4-7. He pystyivät havaitsemaan 2,3 ja 1,6× enemmän proteiiniläiskiä käyttämällä kolmea kapeaa IPG-liuskaa kuin kahta leveämpää gradienttialueen IPG-liuskaa (3-10 ja 4-7).

usealla päällekkäisellä kapealla IPG: llä saavutettava suurempi erottelukyky mahdollistaa useampien proteiinien tunnistamisen, mutta jokainen kapea nauha vaatii erillisen geelilevyn ja tietyn määrän samaa näytettä jokaisen päälle. Tämä vaatimus tarkoittaa, että jos näytteen tilavuus tai pitoisuus on rajallinen, tällainen koe ei välttämättä ole mahdollinen. Rajallisten näytteiden osalta olisi harkittava laajempaa pH-aluetta tai IPGs-yhdisteiden vähimmäismäärää.

kaksiulotteinen Differentiaaligeelielektroforeesi (2D-DIGE)

tavoite erottaa proteiinit 2D-sivun avulla on kaksiulotteinen: i) uusien proteiinien tunnistaminen ja ii) niiden suhteellisen runsauden mittaaminen vertailunäytteiden välillä. 2D-Pagen etuna erotustekniikassa on se, että se ei ainoastaan ratkaise suuria määriä proteiineja, vaan näiden proteiinien värjääminen mahdollistaa proteiinien suhteellisen runsauden määrittämisen. Esimerkiksi kahdesta seeruminäytteestä erotetut proteiinit (terveet ja sairaat) Ladataan kukin erilliselle geelilevylle. Värjäyksen jälkeen proteiiniläiskät kohdistetaan ja skannataan niiden yksilöllisten voimakkuuksien mittaamiseksi. Vaikka monet edistysaskeleet ohjelmistojen linjaus työkaluja on tehty, se on ollut haastavaa varmistaa suora spot-to-spot vertailu kahden erillisen geelit. Vuonna 1997 kehitetty 2-D-differentiaaligeelielektroforeesi (DIGE) voitti tämän rajoituksen sallimalla enintään kolmen eri proteiiniseoksen erottamisen yhden 2D-sivuisen geelin sisällä (13). Tyypillisessä 2D-DIGE-kokeessa proteiineja uutetaan kolmesta eri näytteestä, terveistä, sairaista ja sisäisestä kontrollista (yhdistetty näyte, joka on muodostettu sekoittamalla yhtä paljon proteiineja uutetaan terveistä ja sairaista näytteistä), ovat kovalenttisesti merkittyjä, joista jokaisella on syaniinia fluoresoiva väriaine, jolla on erilainen heräte ja päästöjen aallonpituus. Näytteet ovat siirtymä sovitettu, niin että sama proteiini merkitty millä tahansa väriaineet siirtyy samaan asentoon geeli. Käytetyt syaniinivärit ovat: 1-(5-karboksi-pentyyli)-1′-propyyli-indokarbasyaniinihalidi N-hydroksisukkinimidyyliesteri(Cy3); 1-(5-karboksipentyyli)-1′-metyyli-indodikarbasyaniinihalidi N-hydroksisukkinimidyyliesteri(Cy5); ja 3-(4-karboksimetyyli)fenyylimetyyli-3′ – etyylioksakarbasyaniinihalidi N-hydroksisukkinimidyyliesteri (cy2). Eri tavoin merkittyjen proteiinien ja kontrollinäytteen yhtä suuret pitoisuudet sekoitetaan, levitetään yhdelle geelilevylle ja erotetaan 2D-sivulla. Kontrollinäyte toimii sisäisenä standardina, joka mahdollistaa sekä geelien välisen että sisäisen yhteensopivuuden. Kontrollinäytteen on sisällettävä kaikki kokeessa kaikissa näytteissä esiintyvät valkuaisaineet. Tämä tarkoittaa, että jokaisella kokeen proteiinilla on yksilöllinen signaali sisäisessä standardissa, jota käytetään suoriin kvantitatiivisiin vertailuihin kunkin geelin sisällä ja normalisoimaan kvantitatiivisia runsausarvoja kullekin proteiinille geelien välillä. Geelin Skannaaminen kunkin väriaineen ominaisilla heräteaallonpituuksilla fluoresenssikuvaajan avulla mahdollistaa eri tavoin merkittyjen proteiinien visualisoinnin (Kuva 1). Tämän jälkeen kuvat yhdistetään ja analysoidaan kuvantamisohjelmiston avulla, jonka avulla voidaan vertailla proteiinien runsausasteiden eroja. Digessä oleva arvo poistaa geelin kohdistusvirheen ja takaa tarkan määrityksen (14).

geelistä poistetaan kiinnostavia proteiineja, ne pilkotaan proteolyyttisesti ja tunnistetaan MS: n avulla. Koska se suoritetaan yhdellä geelilevyllä, 2D-DIGE vaatii 50% vähemmän geelejä, mikä tekee siitä taloudellisemman ja proteiinien ilmentymisen erot kahden eri proteiininäytteen välillä helpommaksi vertailla ja tarkemmin kuvata. Lisäksi proteiiniläiskien havaitsemiseen tarvitaan vähemmän aikaa, koska merkintäreaktio DIGESSÄ on nopeampi kuin visualisointi värjäysmenetelmillä. Kun kahden eri näytteen proteiiniekspressiotasoja on vertailtava, valitaan DIGE – menetelmä (15).

2D-sivun vahvuudet ja heikkoudet

elektroforeesi on vakiintunut tekniikka, joka on kokenut useita edistysaskeleita, jotka ovat parantaneet erottelukykyä, havaitsemista, kvantitointia ja uusittavuutta. 2-D SDS-PAGE ja 2D-DIGE lähestymistavat proteiiniprofilointiin ovat helppokäyttöisiä ja taloudellisia menetelmiä, joilla on suuri erotuskyky ja joiden avulla voidaan havaita satoja proteiineja yhdeltä geelilevyltä. Vaikka toistettavuus on ollut ongelma 2D-Pagen kanssa, erityisesti kahden proteiiniseoksen profiloinnissa, on se parantunut huomattavasti 2D-DIGEN käytön myötä. Resoluutiota on parannettu ottamalla käyttöön IPGs-järjestelmä, jonka avulla analyytikko voi räätälöidä pH-gradientin maksimiresoluutiota varten käyttämällä ultrazoom-geelejä, joilla on kapea pH-gradienttialue. Nykyaikaisella 2D-sivulla ei ole tavatonta ratkaista kahta Pi: ssä poikkeavaa proteiinia 0,001 U.

vaikka 2D-PAGE on rajoittanut kykenemättömyyttään ratkaista liian emäksisiä tai liian happamia, liian suuria tai liian pieniä proteiineja, tämä rajoitus pienenee jatkuvasti. Esimerkiksi perusproteiinien erottelua voidaan analysoida IPGs: n avulla pH-alueella 4-12. Erottaminen tiede on aina kehittymässä, ja se ei ole kauan, ennen kuin jäljellä olevat kysymykset geelielektroforeesi on asianmukaisesti ratkaistu.

2D-DIGEN käyttöönotto vaikutti suuresti toistettavuus-ja kvantitointiongelmien ratkaisemiseen. Kuvaajien ja tietokoneiden käyttö mahdollistaa paitsi nopean tiedonhankinnan, hankinnan ja analysoinnin myös pistetunnistuksen, normalisoinnin, proteiiniprofiloinnin, taustakorjauksen sekä tietojen raportoinnin ja viennin. Erottelu -, toteamis-ja kvantitointitekniikkana 2D-DIGE on tärkeä työkalu erityisesti kliinisille laboratorioille, jotka osallistuvat proteiinien ilmentymistasojen määrittämiseen ja taudin biomarkkerin löytämiseen. Kun absoluuttinen biologinen vaihtelu näytteiden välillä on päätavoite, kuten biomarkkerin löytämisessä, 2D-DIGE on valintamenetelmä.

vaikka nongel-menetelmissä (tai ratkaisupohjaisissa) kytkentäfraktiomenetelmissä on tapahtunut merkittävää edistystä suoraan verkossa MS-analyysin kanssa, 2D-PAGE on pysynyt suosittuna tekniikkana proteomitutkimuksissa. Vaikka 2D-Pagella, kuten millä tahansa fraktiointijärjestelmällä, on etunsa ja haittansa, ei ole epäilystäkään siitä, että se pysyy olennaisena tekniikkana proteomien luonnehdinnassa vielä vuosia.