Abstract
Ligustrum vicaryi L. on Ligustrum ovalifolium Hasskin Hybridi. var. Aureo-marginatum ja Ligustrum vulgale L., jotka kuuluvat Oleaceae-heimoon. Sitä käytetään usein koristepensaana kultaisten lehtiensä vuoksi. Sen lääketieteellistä arvoa ei kuitenkaan ole vielä löydetty. Viime aikoina kasvien polysakkaridit ovat herättäneet laajaa huomiota niiden biologisten ominaisuuksien vuoksi, mukaan lukien immunomodulatoriset ja antioksidantit. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli poimia, puhdistaa ja luonnehtia polysakkaridi Ligustrum vicaryi L.-hedelmästä ja tutkia sen immunomodulatorisia ja antioksidanttisia vaikutuksia. Ligustrum vicaryi L.-hedelmäpolysakkaridi (lvfp) saatiin ultraääniuuttamalla, etanolisaostamalla, makroporooisella hartsierotuksella ja dialyysipussin puhdistuksella. Lvfp: n fysikaalis-kemialliset ominaisuudet selvitettiin Fourier-muunnoksen infrapunaspektrometrian, korkean suorituskyvyn ionikromatografian ja korkean suorituskyvyn geelisuodatuskromatografian avulla. Tulokset osoittivat, että lvfp koostui ramnoosista, arabinoosista, galaktoosista ja glukoosista suhteessa 1,79 : 7,55 : 4,58 : 1,54 ja sen molekyylipaino oli 88,949 Da. Lvfp: n immunomodulatorisia ja antioksidanttisia vaikutuksia tutkittiin syklofosfamidin (Cy -) indusoimalla immunosuppressiivisella hiirimallilla. Tulokset osoittivat, että LVFP suurensi merkittävästi pernan ja kateenkorvan indeksejä, paransi neutrofiilien, aktivoituneiden B-ja T-lymfosyyttien fagosyyttistä toimintaa ja suurensi seerumin IL-10-ja TNF-α-pitoisuuksia. Lisäksi havaitsimme, että LVFP lievitti Ky: n aiheuttamaa maksavauriota lisäämällä superoksididismutaasi-(SOD) ja glutationiperoksidaasi-(GSH-px) tasoja. Nämä tulokset viittasivat siihen, että LVFP: llä on immunomodulatorisia ja antioksidanttisia vaikutuksia, minkä vuoksi se luo perustan lvfp: n soveltamiselle lääketeollisuudessa ja funktionaalisessa elintarviketeollisuudessa.
1. Johdanto
immunomodulaattoreita voidaan käyttää ennaltaehkäisevinä tai terapeuttisina strategioina, vahvistaen tai vaimentaen isännän puolustusvastetta. Luontaistuotteita, joilla on immunomodulatorisia ja antioksidanttisia toimintoja, käytetään laajalti useiden sairauksien hoitoon, mukaan lukien autoimmuunisairaus, tulehduksellinen häiriö ja syöpä . Viime aikoina kiinnostus halpoihin ja vähemmän myrkyllisiin luonnontuotteisiin on kasvanut synteettisten solunsalpaajien käytön vuoksi.
Ligustrum vicaryi L. on Ligustrum ovalifolium Hasskin risteymä. var. Aureo-marginatum ja Ligustrum vulgale L., jotka kuuluvat Oleaceae-heimoon . Sillä on lehtivihreätön fenotyyppi, ja sitä käytetään laajalti puutarhapensaana kultaisten lehtiensä vuoksi. Ligustrum vicaryi L. kestää kaasunvaihto-ominaisuuksien ja klorofyllifluoresenssivasteiden perusteella SO2: ta ja sitä voidaan siten käyttää CD-saastuneen maaperän fytostabilointiin . Vaikka Ligustrum vicaryi L.: llä on suuri koriste-ja ympäristönsuojeluarvo, sen terapeuttista potentiaalia ei ole vielä selvitetty.
kasvien polysakkarideilla, jotka ovat perinteisten lääkeyrttien yleisiä tärkeitä biologisia makromolekyylejä, on useita biologisia vaikutuksia, kuten antioksidantti, immunomodulatorinen, antiaging, antitumor ja anti-inflammatoriset vaikutukset . Viime vuosina on tehty monia tutkimuksia, jotka on omistettu kasvien polysakkaridien uuttamiselle ja bioaktiivisuusanalyysille. Kasvien hedelmien polysakkaridit ovat yleisimmin tutkittuja, mukaan lukien jujube-polysakkaridit , persimoni-polysakkaridit ja vesimeloni-polysakkaridit . Tietojemme mukaan Ligustrum vicaryi L. fruit polysakkaridien (lvfps) valmistukseen ja bioaktiviteetteihin perustuvaa tutkimusta ei ole raportoitu.
tässä tutkimuksessa LVFP uutettiin ja puhdistettiin. Seuraavaksi analysoitiin lvfp: n molekyylipaino ja monosakkaridikoostumus. Lisäksi LVFP: n biologisia toimintoja arvioitiin syklofosfamidin (Cy -) indusoimalla immunosuppressiivisella hiirimallilla. Tulokset osoittivat, että lvfp: llä on immunomodulatorinen kyky aktivoimalla sekä synnynnäistä että adaptiivista immuniteettia. Lisäksi lvfp osoitti antioksidanttiaktiivisuutta lisäämällä superoksididismutaasia (SOD) ja glutationiperoksidaasia (GSH-px). Tässä tutkimuksessa esitettiin teoreettinen perusta lvfp: n kehittämiselle vaihtoehtoisena terapeuttisena lääkkeenä immuuniperäisiin sairauksiin.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. Eläinten hyvinvointi ja eettiset lausunnot
kaikki kokeelliset toimenpiteet olivat ARRIVE (animal research: reporting in vivo experiments) – ohjeiden suositusten mukaisia . Jining Medical Universityn Laitoseläinten hoito-ja Käyttökomitea hyväksyi toimenpiteet. Kaikki kokeelliset toimenpiteet tehtiin mahdollisimman inhimillisesti. Yhteensä 100 tervettä, 20-25 gramman painoista Kunming-uroshiirtä säilytettiin olosuhteissa, jotka ylläpitivät 12 tuntia pimeän valon keinotekoista kiertoa ja joissa oli saatavilla ruokaa ja vettä ad libitum. Eläimet säilytettiin normaaleissa eläinhuoneissa, joiden lämpötila oli 20-22°C ja kosteus 55-60%.
2.2. Polysakkaridin uuttaminen ja puhdistus
Ligustrum vicaryi L. hedelmät saatiin kasvitieteellinen puutarha Jining Medical University (Rizhao, Shandong, Kiina) ja tunnistettu Jianan Wang (lääketieteellinen kasvitieteilijä, School of Pharmacy, Jining Medical University). Kuivatut Ligustrum vicaryi L.-hedelmät jauhettiin ja seulottiin 40-silmäisellä seulalla. Jauhe upotettiin asetoniin (jauheen suhde asetoniin oli 1 : 3) ja sitä ravistettiin 24 tunnin ajan lipidien poistamiseksi. Supernatantti heitettiin pois ja ylijääneet kuivatettiin uunissa. Polysakkaridi uutettiin tislatulla vedellä 8 : 1 (v/w) 50°C: ssa 80 minuutin ajan käyttäen 250 W: n ultraäänitehoa. Vesiuute suodatettiin puuvillan avulla. Jäännös poistettiin sentrifugoinnin jälkeen 3000 rpm: ssä 3 minuutin ajan. Seuraavaksi väkevä supernatantti saostettiin 70-prosenttisella etanolilla, ja tämä prosessi toistettiin 95-prosenttisella etanolilla. Kun supernatantti oli poistettu, siihen lisättiin tislattua vettä uutteen liuottamiseksi, ja jäännös poistettiin sentrifugoimalla. Pigmentin poistoon käytettiin makroporista dm101-hartsia. Sevage-reagenssi (kloroformi / 1-butanoli, v / v = 4 : 1) käytettiin proteiinin poistamiseen, kunnes värimuutosreaktiota ei havaittu käyttämällä Coomassie Brilliant Blue g-250-tunnistusta. Polysakkaridit laitettiin pakastuskuivaimeen 24 tunniksi, jotta jäätynyt jauhe saatiin. Polysakkaridin pienet molekyylit poistettiin dialyysipussilla (molekyyliraja 3500 Da) kahden päivän ajan ja tislattu vesi vaihdettiin 12 tunnin välein. Lvfp: n puhdistamiseen käytettiin Kolonnikromatografiaa Sephadex G-200. Lvfp: n puhtauden määrittämiseen käytettiin antronirikkihappomääritystä, jossa oli glukoosin standardikäyrä.
2.3. Fourier-muunnos infrapuna (FTIR) analyysi
Lvfp sekoitettiin puhtaaseen kaliumbromidijauheeseen ja seos laitettiin akaattilaastiin ja jauhettiin tasaisesti infrapunalampun alla. Seos arvioitiin Fourier-muunnoksen infrapunaspektrometrillä IRTracer-100 (Shimadzu, Japani).
2.4. Korkean suorituskyvyn Ionikromatografiassa (HPIC)
HPIC-analyysissä 5 mg LVFP liuotettiin 1 mL: aan 2 mol/L trifluorietikkahappoa ja pantiin hydrolyysiä varten 121°C: seen 2 tunnin ajan. Tämän jälkeen seos suodatettiin 0,45 µm: n mikrohuokoisella suodatuskalvolla. Monosakkaridien kromatografinen erottaminen suoritettiin ICS-5000-ionikromatografilla, joka oli varustettu CarboPac PA20-kolonnilla ja pulssiampeeridetektorilla. Ionikromatografian erotusolosuhteita mukautettiin ja testattiin kahdeksan monosakkaridistandardin seoksella (fukoosi, ramnoosi, arabinoosi, galaktoosi, glukoosi, ksyloosi, mannoosi ja fruktoosi). Parempi erotuskyky saatiin gradienttieluutiolla, jossa virtausnopeus oli vakio 0,5 mL / min. Liikkuva faasi koostui 250 mM NaOH (A), vedestä (sisältää 1 M NaAc%, v/v, B) ja vedestä (C). Eluointi toteutettiin seuraavasti: 2.0% a 0∼21 min; 2, 0% A ja 5, 0% B 21, 1 Min; 2, 0% A ja 20% B 21, 1∼30 min; ja 80% A 30, 1∼50 min.
2.5. Korkean suorituskyvyn Geelisuodatuskromatografia (HPGFC)
polysakkaridin molekyylimassa analysoitiin HPGFC: llä (Waters, New York, USA) ja se oli varustettu rid: llä (2414 taitekerroin-ilmaisin) ja Empower 3-työasemalla. Kromatografiset olosuhteet olivat seuraavat: kromatografinen kolonni: Ultrahydrogel™ Lineaarinen, 300 mm × 7,8 mm × 2, liikkuva faasi: 0,1 m NaNO3, virtausnopeus: 0,9 mL/min ja kolonnin lämpötila: 45°C. Näyte liuotettiin nestefaasiin ja suodatettiin mikrohuokoisella suodatuskalvolla. Kalibrointikäyrässä käytetyt molekyylipainostandardit olivat mw135350, MW36800, MW9750, MW2700 ja MW180.
2.6. Syklofosfamidin (Cy-) indusoima immunosuppressiivinen hiirimalli ja LVFP-hoito
yhteensä 100 hiirtä jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään: kontrolli, Cy, Cy + LVFP (100 mg/kg/vrk), Cy + LVFP (200 mg/kg/vrk) ja Cy + LVFP (400 mg/kg/vrk). Kontrolliryhmälle annettiin normaalia suolaliuosta ja muille neljälle ryhmälle annettiin CY: tä (40 mg/kg) vatsaonteloon joka päivä seitsemän päivän ajan. LVFP: tä annettiin intragastrisessa annostelussa seitsemän peräkkäisen päivän ajan.
2.7. Pernan ja kateenkorvan indeksien
määrittäminen kaikki hiiret punnittiin ja lopetettiin 24 tuntia viimeisen lääkkeen antamisen jälkeen. Perna ja kateenkorva poistettiin ja punnittiin. Pernan tai kateenkorvan indeksi ilmaistiin pernan tai kateenkorvan painon suhteena ruumiinpainoon.
2.8. Hiiren neutrofiilien
Staphylococcus aureuksen fagosytoosia arvioitiin neutrofiilien fagosytoosin määrittämisellä. Lyhyesti sanottuna 40 µL verta saatiin hiiriltä LVFP: n antamisen jälkeen ja laitettiin hepariiniputkeen hyytymisen estämiseksi. Seuraavaksi edellä mainittuun putkeen lisättiin 40 µL bakteerisuspensiota. Seos päällystettiin tasaisesti lasilevyillä ja pidettiin huoneenlämmössä 0,5 tuntia.sitten seos kiinnitettiin 2-3 pisaralla metanolia 5 minuutin ajan ja värjättiin 4-5 pisaralla Wrightin tahraa 5 minuutin ajan. Neutrofiileja havaittiin ja kirjattiin yhteensä 100. Neutrofiilien fagosyyttinopeus ja neutrofiilien fagosyyttinopeus laskettiin seuraavasti: neutrofiilien fagosyyttinopeus = niiden neutrofiilien lukumäärä, jotka osoittivat fagosyyttistä toimintaa / neutrofiilien kokonaismäärä ja neutrofiilien fagosyyttinen indeksi = neutrofiilien nielaisemien bakteerien kokonaismäärä / neutrofiilien kokonaismäärä.
2.9. Seerumin hemolysiinin määrittäminen Elisa
– menetelmällä neljäntenä päivänä hiiriin ruiskutettiin 5% kanan PUNASOLUSUSPENSIOSTA (CRBC) vatsaonteloon (0, 1 mL/10 g). Seitsemäntenä päivänä, 2 tuntia LVFP: n antamisen jälkeen, saatiin 1 mL hiirten verta ja sentrifugoitiin 10 minuutin ajan. Sitten 2 mL: aan normaalia suolaliuosta lisättiin 40 µL seerumia. Seerumiin lisättiin yksi mL 10-prosenttista marsuseerumia ja 1 mL 5-prosenttista CRBC-suspensiota, minkä jälkeen se inkuboitiin vesihauteessa 37°C: ssa 0,5 tunnin ajan. seos sentrifugoitiin ja supernatantti asetettiin 96-kuoppaviljelylevylle. Vastaavan optisen tiheysarvon havaitsi Thermo Scientific Multiskan Mk3 Enzyme Mark instrument (Waltham, MA, USA).
2.10. T-lymfosyyttien Transformaationopeuden määrittäminen
toisena päivänä hiirille annettiin lihakseen 8 mg/kg fytohemagglutiniinia (PHA). Seitsemäntenä päivänä, 2 tuntia LVFP: n antamisen jälkeen, kerättiin retroorbitaalisesta poskiontelosta 40 µL verta, asetettiin liukumäkeen ja värjättiin 4-5 tippaa Wrightin tahraa. Ylimääräinen väriaine huuhdeltiin vedellä 20 minuutin kuluttua. Mikroskoopin avulla havaittiin 100 solua. Transformoituneet lymfosyytit laskettiin seuraavasti: lymfosyyttien transformaationopeus = transformoituneet lymfosyytit / lymfosyyttien kokonaismäärä.
2.11. Viivästyneen Yliherkkyystyypin (DTH) vaste
DTH-vaste tutkittiin korvan turpoamisen asteella. Yleensä, aste korvan turvotusta uskotaan heijastaa aste tulehdus . DTH-vaste mitattiin seuraavasti: toisena päivänä 1 cm2 vatsakarvaa poistettiin Na2S: llä ja vatsan iho peitettiin 25 µL: lla 1-fluori-2,4-dinitrobentseeni (DNFB) – liuosta. Kuudentena päivänä oikean korvan iho päällystettiin 20 µL dnfb-liuoksella. Seitsemäntenä päivänä, 2 tuntia LVFP: n antamisen jälkeen, hiiret uhrattiin ja molemmat korvat poistettiin ja punnittiin. Kahden korvan painoero määritti korvan turpoamisasteen.
2.12. TNF-α: n ja IL-10-sytokiinien osoittaminen seerumista
seitsemäntenä päivänä, 2 tuntia LVFP: n antamisen jälkeen, hiirten veri saatiin retroorbitaalisella sinuspunktiolla, ja se hyytyi luonnollisesti 15 minuutin ajan huoneenlämmössä. Seuraavaksi verta sentrifugoitiin 20 minuutin ajan ja supernatantti kerättiin talteen. Supernatantin TNF-α ja IL-10 havaittiin ELISA-sarjoilla (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kiina).
2.13. Superoksididismutaasin (SOD), glutationiperoksidaasin (GSH-Px) ja Metaanidikarboksyylialdehydin (MDA) pitoisuuksien osoittaminen
kahdeksantena päivänä hiiret lopetettiin ja maksa erotettiin. Jauhamisen ja sentrifugoinnin jälkeen maksakudoksen supernatantti kerättiin SOD: n, GSH-px: n ja MDA: n havaitsemiseksi. SOD, GSH-px ja MDA mitattiin ELISA-sarjoilla (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kiina).
2.14. Hematoksyliini-ja EOSIINIVÄRJÄYS
värjäys tehtiin aiemmin ilmoitetulla tavalla . Kahdeksantena päivänä hiiret lopetettiin ja maksakudokset erotettiin ja kiinnitettiin 10% neutraalipuskuroituun formaliiniin. Parafiiniin upottamisen jälkeen kudokset leikattiin 5 µm: n lohkoiksi. Sitten diat värjättiin hänen kanssaan morfologisten muutosten määrittämiseksi. Kuvat kuvattiin valomikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani).
2.15. Tilastollinen analyysi
kokeelliset koehenkilöt / valmisteet jaettiin satunnaisesti ryhmiin ja saatiin yhtä suuret ryhmäkoot. Ryhmätehtäviä, tietojen tallentamista ja tietojen analysointia ei luovutettu tutkijalle. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD vähintään viidestä riippumattomasta kokeesta. Yksisuuntainen ANOVA mukana Tukeyn useita vertailuja testi käytettiin useita vertailuja käyttäen GraphPad Prism versio 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) , ja pidettiin tilastollisesti merkitsevä.
3. Tulokset
3.1. Lvfp: n FTIR-spektrianalyysi
Lvfp uutettiin lipidinpoistolla asetonin avulla, kuumalla vedellä yhdistettynä ultraääniuuttoon, etanolin saostamisella, pigmentin poistolla makroporooisella hartsilla, deproteinaatiolla Sevage-reagenssilla ja pienimolekyylin poistolla dialyysipussilla. Lisäksi uudelle polysakkaridirakenteelle oli ominaista infrapunaspektroskopia. Lvfp: n FTIR-spektrianalyysi esitetään kuvassa 1(a). Tyypillinen leveä huippu 3345 cm – 1 vastasi O-H (ehkä myös N-H) venytysvärähtelyä. Absorptiopiikki 2929 cm-1 vastasi C-H venytysvärähtelyvaimennuspiikkiä ja sokerin absorptiopiikkiä. Absorptio 1599 cm-1 osoitti-OH: n taivutusvärähtelytilat. Huippu 1412 cm-1 johtui C-H-taivutusvärinästä. Lisäksi absorptiot 1073 cm−1: ssä osoittivat c-O-venytyksen taivutustärinämuodot alkoholihydroksyyliryhmämuodossa.
3.2. HPIC analysoi LVFP: n monosakkaridikoostumuksen
LVFP: n monosakkaridikoostumukset. Kuten kuvioista 1 (b) ja 1 (c) ilmenee, kaikki polysakkarideissa esiintyvät monosakkaridit yksilöitiin monosakkaridistandardien eluutioajan mukaan standardikäyrän avulla. Lvfp koostui pääasiassa ramnoosista, arabinoosista, galaktoosista ja glukoosista moolisuhteessa 1,79 : 7,55 : 4,58 : 1,54.
3.3. LVFP: n molekyylipainon määrittäminen HPGFC: llä
LVFP: n molekyylipainon havaitsi HPGFC. Dekstraanit (molekyylipaino: 180, 2700, 9750, 368000 ja 135350 Da) käytettiin standardeina, koska ne ovat vesiliukoisia ja saatavilla monenlaisina molekyylimassoina. Standardeissa annettiin suuntaviivoja lvfp: n koon arvioimiseksi. Saatiin standardikäyrä (y = -0, 523 x + 13, 01, R2 = 0, 995). Tulokset osoittivat, että lvfp: n molekyylipaino oli 88 949 Da.
3.4. LVFP: n vaikutukset kateenkorvan ja pernan indekseihin Cy: n indusoimalla immunosuppressiivisella hiirellä
Cy: n indusoimalla immunosuppressiivisella hiirimallilla tutkittiin lvfp: n immuunivastetta säätelevää vaikutusta. Cy: tä annettiin intraperitoneaalisena injektiona (40 mg / kg) joka päivä seitsemän päivän ajan. Viiden päivän kuluttua Cy: n antamisesta hiirillä ilmeni oireita, kuten hiustenlähtöä, vähäistä jännitystä, aggressiivisuutta, huonoa ruokahalua ja laihtumista, kun taas kontrolliryhmässä ei havaittu selvää muutosta, mikä osoitti, että eläinmalli oli onnistuneesti luotu. Cy + LVFP-ryhmiä hallinnoitiin lvfp: n eri pitoisuuksina (100, 200 ja 400 mg/kg/vrk) seitsemän peräkkäisen päivän ajan. Pernan ja kateenkorvan indeksit heijastavat elimistön immuunitoimintoja . Lvfp: n vaikutukset kateenkorvan ja pernan indekseihin Cy: n indusoimilla immunosuppressiivisilla hiirillä on esitetty kuvassa 2. Cy-ryhmässä kateenkorvan ja pernan indeksit vähenivät merkittävästi kontrolliryhmään verrattuna. LVFP: n anto suurensi näitä indeksejä merkitsevästi annosriippuvaisesti. Nämä tulokset viittasivat siihen, että lvfp voisi vaikuttaa immuunijärjestelmän parantaa immuniteettia.
(a)
(b)
(a)
(b)
3.5. LVFP: n vaikutukset Neutrofiilifagosytoosiin kyy: n Indusoimilla immunosuppressiivisilla hiirillä
neutrofiilit ovat tehokas puolustus tunkeutuvia mikro-organismeja vastaan . Fagosytoosi on neutrofiilien keskeinen strategia patogeenien tappamisessa . Neutrofiilien aktivoitumista tutkittiin fagosyyttisellä nopeudella ja fagosyyttisellä indeksillä . Kuten kuviosta 3 käy ilmi, Cy-ryhmän fagosyyttinopeus ja fagosyyttinen indeksi olivat vähentyneet merkittävästi kontrolliryhmään verrattuna, mikä viittaa immunosuppressiiviseen tilaan. LVFP (200 mg/kg ja 400 mg/kg) lievitti näitä muutoksia merkittävästi. Nämä tulokset viittasivat siihen, että lvfp voi parantaa neutrofiilien fagosyyttistä toimintaa.
(a)
(b)
(a)
(b)
3.6. LVFP: n vaikutukset humoraaliseen immuniteettiin ja solujen immuniteettiin Cy: n Indusoimilla immunosuppressiivisilla hiirillä
humoraalisella immuniteetilla on ratkaiseva merkitys elimistölle kasvainten ja infektioiden torjunnassa. Seerumin hemolysiinitasoa voidaan käyttää humoraalisen immuunivasteen arvioimiseen . CY-hoito vähensi seerumin hemolysiiniä, ja LVFP vaimensi tätä muutosta merkitsevästi annosriippuvaisesti (Kuva 4(a)). Erilaiset veren antigeenit voivat aktivoida T-lymfosyyttejä. PHA voi toimia mitogeeninä, joka käynnistää T-solujen aktivoitumisen ja proliferaation . T-lymfosyyttitransformaatiokoe suoritettiin hiiren verellä PHA-stimulaation jälkeen LVFP: n läsnä ollessa tai ilman sitä. Kuten kuviosta 4 (b) käy ilmi, kaikki kolme lvfp-annosta estivät huomattavasti Cy: n aiheuttamaa T-lymfosyyttien transformaationopeuden vähenemistä. DTH-vaste on t-soluvälitteinen immuunivaste . DTH vaste arvioitiin mittaamalla aste korvan turvotusta. Kaikki kolme lvfp-annosta heikensivät selvästi Cy: n aiheuttamaa estoa korvan turpoamisasteessa (Kuva 4(c)). Tulokset viittasivat siihen, että LVFP voi aktivoida B-ja T-lymfosyyttejä.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.7. LVFP: n vaikutukset Il-10: n ja TNF-α: n ilmentymiseen immuunisolujen erittämien immunosuppressiivisten hiirten seerumissa
immuunisolujen erittämillä Sytokiineillä on elintärkeä rooli isännän puolustuksessa . IL-10 ja TNF-α ovat keskeisiä tulehdusvälittäjiä . ELISA-tutkimuksessa selvitettiin lvfp: n vaikutukset il-10: n ja TNF-α: n seerumiekspressioon. Tuloksemme osoittivat, että IL-10-ja TNF-α-lausekkeet vähenivät merkittävästi Cy-hoidon jälkeen. Lvfp: n anto suurensi annosriippuvaisesti IL-10-ja TNF-α-tasoja (kuva 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
3.8. LVFP: n vaikutukset oksidatiiviseen stressiin Cy: n aiheuttamalla immunosuppressiivisella hiirellä
lisäksi tässä tutkimuksessa selvitettiin, helpottiko LVFP Cy: n aiheuttamaa oksidatiivista stressiä ja maksavaurioita. SOD muuntaa superoksidianionin H2O2: ksi ja O2: ksi vapaiden radikaalien aiheuttaman vaurion estämiseksi ja neutraloimiseksi . GSH-px: n oletetaan olevan tärkeä endogeeninen puolustus solukalvon peroksidatiivista tuhoutumista vastaan . MDA on lipidiperoksidaation lopputuote ja se voi heijastaa maksakudoksen oksidatiivista vauriota . Kuvissa 6(a)-6 (c) osoitetaan SOD: n ja GSH-px: n merkitsevästi pienentyneet ilmentymät ja suurentuneet MDA-tasot maksakudoksessa Cy-hoidon jälkeen. LVFP suurensi annoksesta riippuvaisesti SOD-ja GSH-px-tasoja ja pienensi myelodysplastista pitoisuutta. Seuraavaksi maksan morfologian muutoksia arvioitiin he-värjäyksen avulla. Kuten kuviosta 6 (d) käy ilmi, Cy-ryhmässä maksasolut olivat harvassa ja epäjärjestyksessä pyknoottisen tuman kanssa. Maksan sinusoidit olivat täynnä punasoluja. Kuten odotettiin, LVFP-ryhmän maksasolut oli järjestetty järjestyneesti selkeällä nukleoluksella, joka oli verrattavissa kontrolliryhmän maksasoluihin. Tulokset osoittivat, että LVFP voisi lieventää Cy: n aiheuttamaa oksidatiivista stressiä ja maksavaurioita.
(a)
(b))
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
4. Keskustelu
tässä tutkimuksessa polysakkaridi uutettiin Ligustrum vicaryi L.-hedelmästä ja sen immunomodulatorisia ja antioksidanttisia vaikutuksia arvioitiin. Polysakkaridi uutettiin kuumalla vedellä yhdistettynä ultraääniuuttoon, etanolin saostukseen, rasvan poistoon asetonilla, pigmentin poistoon dm101-makroporooisella hartsilla, deproteinaatioon Sevage-reagenssilla (kloroformi/1-butanoli, v/V = 4 : 1) ja pienimolekyylin poistoon dialyysipussilla. Lisäksi tälle polysakkaridirakenteelle oli ominaista infrapunaspektroskopia, HPGFC-RID ja HPIC. Tulokset osoittivat, että lvfp : n molekyylipaino on 88 949 Da, ja lvfp koostuu neljästä monosakkaridista eli ramnoosista, arabinoosista, galaktoosista ja glukoosista moolisuhteessa 1,79 : 7,55 : 4,58: 1,54.
immunosuppressio on tilapäinen tai pysyvä immuunijärjestelmän toimintahäiriö, joka voi tehdä organismista herkemmän taudinaiheuttajille. Uusien immunomoduloivien aineiden kehittäminen on yksi tehokkaimmista menetelmistä immunosuppressiivisten sairauksien ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi . Esimerkiksi immunomodulatoriset aineet yhdistettynä kemoterapialääkkeisiin näyttävät olevan hyödyllisiä syöpähoidossa . Useissa raporteissa on havaittu positiivisia korrelaatioita immunomodulatoristen vaikutusten ja polysakkaridien välillä. Ayeka ym. osoitti, että lakritsi (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) polysakkaridilla on immunomodulatorisia vaikutuksia, jotka ilmenevät CD4+-ja CD8+-immuunisolupopulaatioiden aktivoitumisesta ja erilaisten sytokiinien, kuten IL-2: n, IL-6: n ja IL-7: n lisääntyneestä tuotannosta . Chen ym. eristetyt polysakkaridit: Schisandra sphenanthera ja Schisandra chinensis; nämä uutteet voivat parantaa makrofagien fagosyyttistä aktiivisuutta ja parantaa kehon koskemattomuutta . Raporttien mukaan havaittiin, että Schisandra sphenantheran ja Schisandra chinensiksen polysakkaridit koostuivat pääasiassa arabinoosista, glukoosista ja galaktoosista, mikä muistutti LVFP: n koostumusta. Tutkittaessa, oliko LVFP: llä immunomodulatorisia toimintoja, otettiin käyttöön Cy: n aiheuttama immunosuppressio hiirimalli. Cy on solunsalpaaja ja sitä on käytetty immunosuppressiivisten eläinmallien muodostamiseen . Immuunielinten tasolla tulokset osoittivat, että LVFP suurensi merkittävästi pernan ja kateenkorvan indeksejä Cy: n indusoimilla immunosuppressiivisilla hiirillä. Immuunisolujen tasolla havaittiin, että lvfp paransi neutrofiilien fagosyyttistä toimintaa ja edisti B-ja T-lymfosyyttien aktivaatiota. Nämä tiedot osoittavat, että lvfp voi parantaa sekä synnynnäistä että adaptiivista immuniteettia.
lisäksi tutkittiin seerumin immuunisidonnaisia sytokiineja, ja tulokset osoittivat, että LVFP nosti IL-10-ja TNF-α-tasoja. Kerrotaan, että useat polysakkaridit voivat vaikuttaa tulehdustekijöiden ilmentymiseen. Chen ym. havaittu, että sulfatoidut polysakkaridit filamenttisesta mikrolevästä Tribonema sp. voi parantaa IL-6: n, IL-10: n ja TNF-α: n lausekkeita makrofageissa . Cheng ym. raportoitu, että luonnonvaraisen Lactarius deliciosus-bakteerin polysakkaridit lisäsivät TNF-α: n, IL-1β: n ja IL-6: n eritystä makrofageissa . Wang ym. ilmoitti, että jäkälän Umbilicaria esculenta polysakkaridi indusoi TNF-α: n, IFN-γ: n, IL-1β: n, IL-6: n ja IL-10: n vapautumista hiiren makrofageissa .
antioksidantit ovat aineita, jotka estävät hapettumista ihmiskehossa. Yleensä reaktiivisen happilajin tuotannon ja antioksidanttisen puolustusjärjestelmän välillä vallitsee tasapaino, joka on välttämätön normaalissa aineenvaihdunnassa. Solut tuottavat joitakin endogeenisia antioksidantteja, kuten SOD-ja GSH-px-yhdisteitä liiallisten vapaiden radikaalien tukahduttamiseksi . Tässä tutkimuksessa määritettiin Lvfp: n antioksidanttiaktiivisuus Cy: n indusoimilla immunosuppressiivisilla hiirillä. Tulokset osoittivat, että SOD-ja GSH-px-lausekkeet lisääntyivät merkittävästi LVFP: ssä. Lisäksi lvfp laski MDA: n ilmentymistä, mikä viittaa hapetusvaurioon maksassa. Hänen värjäyksensä osoitti, että LVFP voi lievittää Cy: n aiheuttamia maksasoluvaurioita. Näin ollen voidaan päätellä, että lvfp saattaa suojata soluja oksidatiivisen stressin aiheuttamilta vaurioilta lisäämällä antioksidanttien, kuten SOD: n ja GSH-px: n tuotantoa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ramnoosin, arabinoosin ja galaktoosin pitoisuus monosakkaridikoostumuksessa voi vaikuttaa antioksidanttiaktiivisuuteen . Ramnoosin, arabinoosin ja galaktoosin pitoisuus LVFP: ssä on suurempi, mikä voi olla tärkeää lvfp: n osoittaman voimakkaamman antioksidanttiaktiivisuuden kannalta.
kaiken kaikkiaan uutettiin Ligustrum vicaryi L.-hedelmästä saatuja polysakkarideja ja tutkittiin niiden fysikaaliset ja biologiset ominaisuudet. Lvfp: tä voitaisiin tutkia mahdollisena immunomodulaattorina ja antioksidanttina terapeuttiseen käyttöön immunosuppressiivisissa sairauksissa, mikä mahdollistaisi perinteisen kiinalaisen lääketieteen tuomisen kansainvälisille markkinoille.
5. Päätelmät
johtopäätöksenä voidaan todeta, että Lvfp uutettiin ja puhdistettiin Ligustrum vicaryi L.-hedelmästä, jonka molekyylipaino oli 88 949 Da ja joka koostui neljästä monosakkaridista eli ramnoosista, arabinoosista, galaktoosista ja glukoosista. Alustavat farmakologiset tutkimukset osoittivat, että lvfp voisi tehokkaasti parantaa immuunitoimintoja ja sillä olisi antioksidanttiaktiivisuutta. Tämä tutkimus osoittaa, että lvfp voi olla lupaava immunomodulatorinen ja antioksidantti lääkehoitoihin (Kuva 7).
tietojen saatavuus
tämän tutkimuksen tulosten tueksi käytetyt TIF-tiedot ovat pyynnöstä saatavissa vastaavalta tekijältä.
eturistiriidat
kirjoittajat ilmoittavat, ettei tämän paperin julkaisemiseen liity eturistiriitoja.
kiitokset
tätä työtä ovat tukeneet National Natural Science Foundation of China (81800399), Jining Medical University Doctoral Research Startup Fund, Fund for National-Level College Students’ Innovation and Entrepreneurship Training Project (201610443011), Shandong Traditional Chinese Medicine Science and Technology Development Program (2019-0450) ja Jining Medical University Student Innovation Training Program (Cx2016011/Cx2019092).