Électrophorèse sur gel de polyacrylamide bidimensionnel (PAGE 2D): avancées et perspectives

Introduction

Les 25 dernières années, et en particulier la dernière décennie, ont vu un effort accru pour développer des technologies capables d’identifier et de quantifier un grand nombre de protéines exprimées dans un système cellulaire (c’est-à-dire le protéome) dans l’espoir de détecter des biomarqueurs de maladies, de cartographier les circuits protéiques ou d’identifier de nouveaux sites de phosphorylation, par exemple. La complexité du protéome a fait du développement de méthodes de séparation efficace et de détection sensible des protéines une composante essentielle de cet effort. Les progrès continus de la technologie de spectrométrie de masse (MS) ont permis la détection de protéines avec une vitesse et une sensibilité beaucoup plus grandes qu’auparavant. Cependant, même une SEP de pointe est incapable de caractériser tous les composants d’un protéome complexe. Les scientifiques adoptent une approche « diviser pour régner » pour caractériser les protéomes, en ce sens qu’ils tentent de limiter temporellement le nombre de protéines que le spectromètre de masse est invité à analyser. En étalant le protéome, plus de protéines seront finalement analysées au sein d’une expérience individuelle.

Pour séparer les protéomes, les scientifiques ont utilisé des technologies électrophorétiques et chromatographiques, séparément et en combinaison, et hors ligne et en ligne. Bien que ces efforts puissent entraîner la séparation et l’identification de milliers de protéines, aucune méthode unique ne peut résoudre toutes les protéines d’un protéome, en raison de leur grand nombre et de leur plage dynamique de concentration. Les séparations à dimension unique sont insuffisantes pour résoudre efficacement les mélanges de protéines complexes. Ce fait a été reconnu il y a plus d’un demi-siècle par Smithies et Poulik (1), qui ont reconnu qu’une combinaison de deux processus électrophorétiques sur un gel à angle droit devrait donner un degré de résolution beaucoup plus élevé que ce qui est possible avec l’un ou l’autre séparément. Les deux processus électrophorétiques sont la résolution par taille moléculaire et la mobilité libre de la solution sur un gel d’amidon. Leur prédiction continue d’être prouvée et a servi de base au développement de méthodologies multidimensionnelles orthogonales pour la séparation de mélanges complexes non seulement par électrophorèse sur gel, mais également par chromatographie et électrophorèse capillaire.

Pour bien comprendre les progrès réalisés en PAGE bidimensionnelle (2D-PAGE), il faut remonter bien plus loin qu’un quart de siècle. En 1930, Tiselius a introduit la méthode des limites mobiles comme outil analytique pour étudier l’électrophorèse des protéines (2). Depuis ses travaux pionniers, diverses formes d’électrophorèse ont été utilisées pour la séparation de mélanges complexes de protéines, chacune avec une résolution améliorée. Dès 1962, Raymond et Aurell (3) ont démontré les effets non linéaires significatifs de la concentration en gel sur la mobilité électrophorétique des protéines en utilisant une électrophorèse 2D utilisant différentes concentrations en gel d’acrylamide pour séparer les protéines sériques. Deux ans plus tard, Raymond (4) a démontré la supériorité des gels à plaques plates par rapport aux gels à tubes cylindriques. Par exemple, la dalle plate fournit une surface maximale pour refroidir le gel; les motifs résultants sont plus faciles à quantifier dans les densitomètres d’enregistrement standard; un grand nombre d’échantillons peuvent être traités à l’aide d’une seule plaque de gel, facilitant la comparaison directe des échantillons traités dans des conditions identiques; et, surtout, la dalle plate permet l’application de séparations 2-D. Ces préférences perspicaces se sont avérées vraies et sont pratiquées aujourd’hui dans de nombreux laboratoires de bioanalyse.

Une autre avancée dans les séparations de gel 2D a été introduite en 1972 par Wright (5), qui a utilisé une colonne de gel de polyacrylamide à 4,75% (2% de réticulation) dans la première dimension, qui a ensuite été retirée du cylindre de verre et posée sur le bord supérieur d’une dalle à gradient de 2%. Après électrophorèse, la dalle de gel a été placée dans une solution de coloration, ce qui a permis de visualiser 112 protéines sériques humaines résolues.

Ces nouvelles approches n’ont résolu qu’un petit nombre de protéines, principalement les protéines les plus abondantes d’un protéome cellulaire ou sérique. L’introduction de la PAGE 2D en 1975 par O’Farrell (6) pour séparer les protéines cellulaires dans des conditions dénaturantes a permis la résolution de centaines de protéines. Le principe appliqué était très simple: les protéines ont été résolues sur gel en utilisant la focalisation isoélectrique (IEF), qui sépare les protéines dans la première dimension en fonction de leur point isoélectrique, suivie d’une électrophorèse dans une deuxième dimension en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS), qui sépare les protéines en fonction de leur masse moléculaire. La méthode d’O’Farrell est vraiment à la base de la PAGE 2D moderne, qui a été rapidement adaptée et largement acceptée par d’autres chercheurs. Anderson et Anderson (7) ont utilisé la PAGE 2D pour l’analyse des protéines plasmatiques humaines. Ils ont pu séparer et détecter environ 300 taches de protéines distinctes lors de la coloration. Contrairement à O’Farrell, Manabe (8) a séparé les protéines plasmatiques humaines à l’aide de la PAGE 2D sans agents dénaturants. Environ 230 taches de protéines ont pu être observées sur le gel; cependant, les taches étaient maculées et mal résolues.

Introduction de Gradients de pH Immobilisés

Comme mentionné ci-dessus, la 2D-PAGE comprend IEF dans la première dimension, suivie de la SDS-PAGE dans la deuxième dimension. Depuis son introduction par Kolin en 1954 (9), l’IEF a connu plusieurs avancées. La première dimension est réalisée dans des bâtonnets de gel de polyacrylamide formés dans des tubes de verre ou de plastique et contenant des ampholytes qui forment un gradient de pH dans un champ électrique. Ces tiges étaient historiquement irréproductibles, instables et difficiles à travailler. L’introduction de gradients de pH immobilisés (IPG) par Bjellqvist et al. (10) a eu un impact significatif sur l’utilisation de l’IEF pour séparer des mélanges complexes sur une large plage de pH. Les IGP ont permis la formation de gradients de pH stables et reproductibles capables de focaliser les protéines acides et basiques sur un seul gel préparé avec de larges gradients de pH. Dans les GIP, les ampholytes porteurs sont attachés à des molécules d’acrylamide et coulés dans les gels pour former un gradient de pH fixe. La fixation du gradient empêche la dérive dans le gel et garantit également qu’ils peuvent être coulés de manière efficace et reproductible. L’utilisation de bandes IPG à plage étroite a permis de séparer un plus grand nombre de protéines que ce qui avait été possible avec la PAGE 2D standard, car une plage de pH plus étroite était répartie sur une plus grande distance physique. Cette propagation a permis de séparer des protéines ayant des valeurs de point isoélectrique (pI) similaires avec une résolution plus élevée. Pour illustrer ce point, Hoving et al. a développé une méthode de 2 PAGES dans laquelle ils ont appliqué des bandes IPG à plage étroite dans la première dimension (11). Les bandes d’IPG avaient généralement une largeur de 1 à 3 pH U et se chevauchaient d’au moins 0,5 pH U. Six bandes d’IPG couvrant la plage de pH de 3,5 à 10 ont été utilisées. Des protéines d’une lignée cellulaire de lymphome B ont été appliquées sur chaque bandelette et séparées à l’aide d’IEF. Chaque bande a ensuite été appliquée sur une plaque de gel individuelle SDS-PAGE et les protéines ont été séparées dans la deuxième dimension en fonction de leur poids moléculaire. Environ 5000 taches distinctes ont été détectées à l’aide des six bandes d’IPG, contre 1500 taches détectées à l’aide d’une seule bande d’IPG avec une plage de pH de 3 à 10 et une seule plaque de gel standard de 2 PAGES. Wildgruber et coll. (12) a comparé l’utilisation de 3 bandes d’IPG avec des plages de pH de 4-5, 5-6 et 5,5–6,7 contre des gels exécutés avec des bandes d’IPG avec des plages de gradient de pH de 3-10 et 4-7. Ils ont pu détecter 2,3 et 1,6 × plus de taches de protéines en utilisant trois bandes IPG à plage étroite qu’avec les deux bandes IPG à plage de gradient plus large (3-10 et 4-7), respectivement.

Bien que la résolution plus élevée obtenue en utilisant plusieurs IPG étroits qui se chevauchent permette d’identifier plus de protéines, chaque bande étroite nécessite une plaque de gel séparée et une certaine quantité du même échantillon à charger sur chacune. Cette exigence signifie que si le volume ou la concentration de l’échantillon est limité, une telle expérience peut ne pas être possible. Pour des échantillons limités, une plage de pH plus large ou un nombre minimum de GIP doivent être envisagés.

Électrophorèse différentielle bidimensionnelle dans le gel (DIGE 2D)

L’objectif de la séparation des protéines à l’aide de la PAGE 2D est double: (i) identifier de nouvelles protéines et (ii) mesurer leur abondance relative entre des échantillons comparatifs. Un avantage de la 2D-PAGE en tant que technique de séparation est qu’elle résout non seulement un grand nombre de protéines, mais la coloration de ces protéines permet de quantifier les abondances relatives des protéines. Par exemple, les protéines extraites de deux échantillons de sérum (sain et malade) sont chacune chargées sur une plaque de gel séparée. Après coloration, les taches de protéines sont alignées et scannées pour mesurer leurs intensités individuelles. Bien que de nombreux progrès aient été réalisés dans les outils d’alignement logiciel, il a été difficile d’assurer une comparaison directe entre deux gels distincts. Le développement de l’électrophorèse différentielle en gel 2D (DIGE) en 1997 a permis de surmonter cette limitation en permettant de séparer jusqu’à trois mélanges de protéines distincts dans un seul gel de PAGE 2D (13). Dans une expérience 2D-DIGE typique, les protéines extraites de trois échantillons différents, sains, malades et témoins internes (un échantillon regroupé formé en mélangeant des quantités égales de protéines extraites des échantillons sains et malades), sont marquées de manière covalente, chacune avec un colorant fluorescent cyanine qui a une longueur d’onde d’excitation et d’émission différente. Les échantillons sont appariés à la migration, de sorte que la même protéine marquée avec l’un des colorants migre vers la même position sur le gel. Les colorants cyanine qui ont été utilisés sont: Halogénure de 1-(5-carboxy-pentyl)-1′-propylindocarbacyanine Ester de N-hydroxysuccinimidyle (Cy3); 1-(5-carboxypentyl)-1′-méthylindodicar-bacyanine ester de N-hydroxysuccinimidyle (Cy5); et 3- (4-carboxyméthyl) phénylméthyl-3′-éthyloxacarbacyanine halogénure de N-hydroxysuccinimidyle Ester (cy2 ). Des concentrations égales des protéines marquées différemment et de l’échantillon témoin sont mélangées, appliquées sur une seule plaque de gel et séparées à l’aide d’une PAGE 2D. L’échantillon de contrôle sert de standard interne, permettant une correspondance inter et intra-gel. L’échantillon témoin doit contenir toutes les protéines présentes dans tous les échantillons d’une expérience. Cela signifie que chaque protéine de l’expérience a un signal unique dans l’étalon interne, qui est utilisé pour des comparaisons quantitatives directes au sein de chaque gel et pour normaliser les valeurs d’abondance quantitatives pour chaque protéine entre les gels. Le balayage du gel aux longueurs d’onde d’excitation spécifiques de chaque colorant, à l’aide d’un imageur à fluorescence, permet de visualiser les protéines marquées différemment (Figure 1). Les images sont ensuite fusionnées et analysées à l’aide d’un logiciel d’imagerie, ce qui permet de comparer les différences entre les niveaux d’abondance des protéines. La valeur en DIGE élimine toute erreur liée au désalignement du gel et assure une quantification précise (14).

Les protéines d’intérêt sont excisées du gel, digérées protéolytiquement et identifiées à l’aide de la SEP. Comme il est réalisé à l’aide d’une seule plaque de gel, 2D-DIGE nécessite 50% moins de gels, ce qui le rend plus économique et les différences d’expression des protéines entre deux échantillons différents de protéines sont plus faciles à comparer et à imager avec plus de précision. De plus, il faut moins de temps pour détecter les taches de protéines car la réaction de marquage dans DIGE est plus rapide que la visualisation à l’aide de méthodes de coloration. Lorsqu’il est nécessaire de comparer les niveaux d’expression protéique de deux échantillons différents, DIGE est la méthode de choix (15).

Forces et faiblesses de la 2D-PAGE

L’électrophorèse est une technique établie qui a fait l’objet de plusieurs avancées qui ont amélioré la résolution, la détection, la quantification et la reproductibilité. Les approches 2D SDS-PAGE et 2D-DIGE du profilage des protéines sont des méthodes accessibles et économiques qui possèdent un pouvoir de résolution élevé et permettent la détection de centaines de protéines sur une seule plaque de gel. Bien que la reproductibilité ait été un problème avec 2D-PAGE, en particulier lors du profilage de deux mélanges de protéines, elle a été considérablement améliorée avec l’utilisation de 2D-DIGE. La résolution a été améliorée par l’introduction d’IPG, qui permettent à l’analyste d’adapter le gradient de pH pour une résolution maximale à l’aide de gels ultrazoom avec une plage de gradient de pH étroite. Avec la 2D-PAGE moderne, il n’est pas rare de résoudre deux protéines qui diffèrent en pI de 0,001 U.

Bien que la 2D-PAGE ait été limitée par son incapacité à résoudre des protéines trop basiques ou trop acides, trop grandes ou trop petites, cette limitation diminue continuellement. Par exemple, la séparation des protéines basiques peut être analysée à l’aide d’IPG dans la plage de pH de 4 à 12. La science de la séparation est en constante évolution et il ne faudra pas longtemps avant que les problèmes restants de l’électrophorèse sur gel soient résolus de manière adéquate.

L’introduction de la 2D-DIGE a énormément contribué à résoudre les problèmes de reproductibilité et de quantification. L’utilisation d’imageurs et d’ordinateurs permet non seulement une exploration, une acquisition et une analyse rapides des données, mais également la détection, la normalisation, le profilage des protéines, la correction de l’arrière-plan, la création de rapports et l’exportation de données. En tant que technique de séparation, de détection et de quantification, le 2D-DIGE est un outil important, en particulier pour les laboratoires cliniques impliqués dans la détermination des niveaux d’expression des protéines et la découverte de biomarqueurs de maladies. Lorsque la variation biologique absolue entre les échantillons est l’objectif principal, comme dans la découverte de biomarqueurs, la 2D-DIGE est la méthode de choix.

Bien qu’il y ait eu des progrès significatifs dans les méthodes non ligneuses (ou basées sur des solutions) pour coupler les méthodes de fractionnement directement en ligne avec l’analyse de la SEP, la 2D-PAGE est restée une technique populaire pour mener des études protéomiques. Bien que la 2D-PAGE, comme tout schéma de fractionnement, présente ses avantages et ses inconvénients, il ne fait aucun doute qu’elle restera une technique essentielle pour la caractérisation des protéomes pendant de nombreuses années à venir.