A rule-based model of insulin signaling pathway

The model of insulin signaling pathway

Partendo da tre modelli pubblicati , abbiamo implementato il modello di ISP come illustrato in Fig. 1 utilizzando la notazione grafica Systems Biology .

Il modello comprende molti degli elementi essenziali responsabili dell’azione insulinica, poiché sono incluse le tre principali sotto-vie dell’ISP, brevemente descritte di seguito.

Il percorso PI3K-AKT

Per il percorso PI3K-Akt, ci riferiamo principalmente al modello in Sedaghat et al. . Il modello è stato utilizzato da diversi gruppi di ricerca e comprende molti dei componenti di segnalazione più noti che mediano la traslocazione del trasportatore di glucosio GLUT4. Questi includono il recettore dell’insulina che lega e ricicla sottosistemi; il sottosistema di segnalazione post-recettore che include sia la fosforilazione di Ser e Tyr al substrato del recettore dell’insulina1( IRS1); la formazione di un complesso (complesso IRS1_PI3K) tra IRS1 fosforilato e fosfatidilinositide 3-chinasi (PI3K); il fosfatidilinositolo 3,4,5-trisfosfati PI (3,4,5); la fosforilazione della proteina chinasi B (AKT) e della proteina chinasi C (PKC)-ζ; la traslocazione di GLUT4 alla membrana plasmatica. Anche gli effetti della tirosina fosfatasi proteica (PTP1B) e delle fosfatasi lipidiche (SHIP2 e PTEN) sono considerati nel modello.

Il percorso TSC1/2-mTOR

Per il percorso TSC1/2-mTOR ci riferiamo principalmente al modello recentemente pubblicato in Sonntag et al. , descrivendo l’effetto mTOR in risposta all’insulina e agli amminoacidi. Il modello considera entrambi i complessi mTOR: mTORC1 e mTORC2. mTORC1 attivazione dipende dalla presenza di aminoacidi ed è inibita dalle proteine sclerosi tuberosa 1 e 2 (TSC1/2) attivazione (cioè fosforilazione Ser), che, a sua volta, dipende dalla 5′ AMP-attivato protein chinasi (AMPK) attivazione. L’attivazione di AMPK dipende dalla fosforilazione di IRS1 Tyr, mentre l’inibizione di TSC1 / 2 (cioè la fosforilazione di Tyr) dipende dalla fosforilazione di AKT a Thr309. mTORC2, che è stato recentemente identificato come la proteina chinasi 2 fosfoinositide-dipendente sconosciuta (PDK2), cioè la chinasi responsabile della fosforilazione Ser474 di AKT, contribuisce alla doppia fosforilazione di AKT insieme alla fosforilazione Thr309, operata dalla chinasi proteica fosfoinositide-dipendente 1 (PDK1). Sonntag et al. formulare l’ipotesi della presenza di una variante PI3K, che è direttamente regolata dal recettore dell’insulina attivato e, a sua volta, attiva mTORC2. Abbiamo incluso questa ipotesi nel nostro modello.

Il percorso RAS-MAPK

Per il percorso RAS-MAPK, ci riferiamo principalmente al modello in Borisov et al. , descrivendo sia le stimolazioni dell’insulina che dell’EGF. Il modello include tutti i principali meccanismi chimici coinvolti nel pathway RAS-MAPK: l’interazione di Tyr fosforilata IRS1 con SHP2 (il dominio SH2-contenenti proteina tirosina chinasi 2) e GRB2-SOS complesso (il recettore del fattore di crescita-bound 2 e il figlio di sevenless complesso), formando così la SHP2-IRS1 e GRB2/SOS-IRS1 complessi, rispettivamente; il GTP – binding della RAS; la fosforilazione di RAF proto-oncogene-serina/treonina chinasi di proteina c-RAF); l’interazione di recettore di insulina con Ras gtpase che attiva proteina (RASGAP), che a sua volta catalizza il processo inverso di disattivazione di Ras; l’attivazione del proto-oncogene tyrosine-protein kinase SRC che completamente attiva c-RAF; la specificità doppia mitogen-activated kinase 1/2 (MEK1/2); il extracellular-signal-regulated kinases (ERK1/2).

Integrazione dei percorsi PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR e RAS-MAPK

I percorsi PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR e RAS-MAPK contengono diverse parti sovrapposte, che, nei documenti originali, erano spesso modellate in modi diversi basandosi su ipotesi leggermente diverse. Abbiamo confrontato le reazioni sovrapposte tra diversi modelli e implementato la versione più aggiornata di esse sulla base delle attuali conoscenze della biochimica cellulare. Inoltre, l’integrazione dei tre modelli ha richiesto di trattare con le diverse unità di misura adottate per descrivere le variabili di stato. Mentre gli esperimenti immunoblot consentono di ottenere informazioni importanti sulla scala temporale degli eventi di segnalazione, le informazioni quantitative sull’espressione proteica sono spesso problematiche da recuperare in modo che i profili di concentrazione previsti siano talvolta riportati in concentrazione micromolare, come in Borisov et al. , o in unità arbitrarie (AU), come in Sonntag et al. . Al contrario, in Sedaghat et al. , la concentrazione è stata espressa in unità molari o in percentuale della concentrazione totale (ad esempio, la concentrazione di citosol GLUT4 è stata considerata pari al 96% della concentrazione totale di GLUT4 nella cellula alla condizione basale).

Potenzialmente, RBM consente di eseguire simulazioni sia deterministiche che stocastiche, a condizione che le grandezze variabili siano espresse in copie di molecole per cellula. Anche se nel presente lavoro non abbiamo usato la simulazione stocastica, abbiamo allineato tutte le variabili alla stessa unità, cioè numero di molecole per cellule, moltiplicando le unità molari per NA * V (NA indica il numero di Avogadro e V il volume cellulare, considerato pari a 3e-12 l). Tutti i dettagli sulla conversione di unità da AU e concentrazioni percentuali sono riportati in Materiale e metodi.

Il modello risultante è costituito da 42 regole di reazione e 101 parametri che codificano le interazioni tra 61 specie chimiche distinte. Le reazioni, i valori dei parametri e le condizioni iniziali sono tutti riportati nel file aggiuntivo 1.

Novità del modello RBM-ISP

L’implementazione di RBM, ha facilitato la contabilizzazione di una serie di caratteristiche dell’ISP, come la fosforilazione di proteine segnalanti in più siti e con effetti multipli, l’interazione simultanea di molecole con diversi partner di legame e la localizzazione subcellulare di alcune reazioni. Le caratteristiche sopra elencate sono discusse in dettaglio nel seguito.

La fosforilazione di proteine segnalanti su più siti

Le molecole segnalanti possono avere diversi livelli di attività, a seconda dei residui fosforilati. Si consideri ad esempio IRS1 e AKT. L’IRS1 ha molti residui potenzialmente coinvolti nelle modifiche post-traduzionali e può essere attivato o inibito nella sua azione chinasica, a seconda che il residuo fosforilato sia Tyr o Ser . Ad esempio, la fosforilazione Tyr-896 è necessaria per il legame PI3K, SHP2 e GRB2, mentre la fosforilazione Ser-636 di p70S6K è un meccanismo correlato alla resistenza all’insulina . AKT, al contrario, può essere attivato dalla fosforilazione a Thr309 o Ser474 da PDK1 e mTORC2, rispettivamente .

L’attivazione/inibizione dipendente dalla fosforilazione IRS1 era già inclusa nel modello Sedeghat, sebbene si considerasse la fosforilazione Ser regolata da PKC e non da p70S6K, come nel modello Sonntag. Qui abbiamo modellato sia le azioni PKC che p70S6K e descritto la formazione/dissociazione complessa pIRS1-Tyr896 con PI3K, SHP2 e GRB2 .

I due siti di fosforilazione di AKT non sono stati esplicitamente modellati in Sedaghat et al. . Abbiamo modellato la fosforilazione AKT a Thr mediata da PI(3,4,5)P3 come in Sedaghat et al. modello e la fosforilazione AKT a Ser mediata da mTORC2 come in Sonntag et al. modello e assunto:

i)
AKT fosforilata sia a Thr o entrambi i siti di agire su di TSC1/2 complesso di mediare la sua fosforilazione a Tyr e defosforilazione a Ser ;
ii)
la fosforilazione di AKT al Ser o entrambi i siti per inattivare C-RAF ;
iii)
la fosforilazione di AKT in Thr o Ser per attivare traslocazione GLUT4 .

Interazione con più partner di legame

L’interazione delle molecole nei percorsi di segnalazione con numerosi partner di legame diversi porta alla potenziale formazione di complessi diversi. In ISP, IRS1 fosforilato a Tyr-896 può legare PI3K come modellato in Sedaghat et al. o GRB2 / SOS e SHP2, come modellato in Borisov et al. . Al fine di abbinare la specifica del modello RBM-ISP con le conoscenze attuali, abbiamo permesso la formazione di diversi complessi. Pertanto, IRS1 può legare in modo reciprocamente esclusivo GRB2 / SOS e SHP2, ma può legare contemporaneamente GRB2/SOS e la subunità normativa p85 di PI3K .

Informazioni sulla localizzazione subcellulare nelle regole di reazione

La possibilità che le proteine debbano interagire è spesso correlata alla loro localizzazione fisica, cioè alla loro presenza nello spazio extra-cellulare, citoplasma, nucleo, membrana plasmatica, ecc. Ad esempio, i lipidi PI(3,4,5)P3 funzionano come siti di docking della membrana plasmatica che reclutano diverse proteine contenenti domini di omologia di pleckstrina (PH) (ad es. AKT e PDK1) e la loro co-localizzazione possono accelerare specifici eventi di segnalazione . Un altro esempio è l’interazione di mTORC1 con l’omologo Ras arricchito nel cervello (RHEB) e la famiglia Rag sulla membrana del lisosoma, riportata da Zoncu et al. . Nel nostro modello, abbiamo incluso le informazioni sulla localizzazione subcellulare per il recettore dell’insulina e il trasportatore GLUT4, distinguendo tra la loro localizzazione plasmatica e citoplasmatica secondo la descrizione matematica fornita da Sedaghat et al. .

Previsioni del modello

I profili di concentrazione di tutte le specie chimiche che popolano il modello sono stati simulati su una stimolazione insulinica di 60 min e 100 nM. La concentrazione di 100 nM rappresenta un livello ben accettato di stimolazione dell’insulina nelle colture cellulari comunemente presenti in letteratura e utilizzate anche dal nostro gruppo . Secondo Sonntag et al. , abbiamo anche assunto una stimolazione costante degli aminoacidi, necessaria per ottenere l’attivazione mTORC1 e il feedback di p70S6K su IRS1. Per valutare l’affidabilità del modello, le previsioni del modello sono state confrontate con i dati sperimentali disponibili nel nostro set di dati per alcune fosfoproteine al tempo 2, 5, 10, 30 e 60 min dopo insulina più aminoacidi, cioè leucina, stimolazione . Come mostrato in Fig. 2, i profili sperimentali e previsti di pAKT – S473 e pmTORC1-S2448 sono in buon accordo, poiché entrambi mostrano un modello di fosforilazione crescente raggiungendo uno stato stazionario nei primi 2-5 min e 20-30 min, rispettivamente. Il profilo previsto per ppERK1 / 2-Y202,Y204 è confermato dai dati sperimentali nei primi 10 min, mentre negli ultimi punti temporali diminuisce rapidamente nei dati sperimentali rispetto alle previsioni del modello. Il profilo osservato nei dati sperimentali per ppERK1/2-Y202,Y204, potrebbe essere più strettamente abbinato aumentando la forza del feedback tra ppERK1/2-Y202,Y204 e GRB2 / SOS. In Fig. 2 (pannello in alto a destra, linea tratteggiata), viene mostrato il profilo simulato di ppERK1/2-Y202, Y204 ottenuto moltiplicando il parametro kcat39 (vedi file aggiuntivo 1) per un fattore 10. Si noti che nel modello ISP RBM disponibile online, abbiamo deciso di lasciare invariato il parametro del modello, ad es. usiamo il valore della letteratura , posticipando l’ottimizzazione dei parametri per studi futuri, quando saranno disponibili ulteriori dati. Sfortunatamente, i dati sperimentali di pP70S6K-T389 non erano affidabili (solo una replica disponibile), quindi non possiamo confrontare i profili sperimentali e simulati per questa proteina, che è un endpoint del percorso con un’importante azione di feedback su IRS1. Tuttavia, il profilo simulato mostrato in Fig. 2 (in basso, pannello destro) assomiglia dati sperimentali mostrati in altri documenti .

Abbiamo esaminato i profili previsti di tutte le specie attive e li abbiamo raggruppati in quattro gruppi in base al loro comportamento dinamico, come mostrato in Fig. 3:

tempo di risposta Veloce, il raggiungimento dello stato stazionario entro 2-5 min (blu)
Veloce superamento risposta, raggiungendo il picco nel giro di 2-5 min e poi lo stato stazionario dopo 10-20 min (verde)
risposta Lenta, il raggiungimento dello stato stazionario in 10-20 min (arancione)
Lento superamento risposte, raggiungendo il picco nel 5-10 min e lo stato stazionario in 30-60 min (viola).

Dopo la stimolazione dell’insulina, il recettore dell’insulina risponde rapidamente fosforilando e innescando una cascata di eventi lungo percorsi distinti. Lungo la via PI3K-AKT, tutti i meccanismi strettamente correlati alla fosforilazione IRS1 Tyr sono caratterizzati da una risposta rapida. Lo stesso vale per altri bersagli diretti di IRS1 fosforilati a Tyr lungo la cascata TSC1/2-mTOR, cioè la fosforilazione di AMPK a T172, la formazione di complessi SHP2-IRS1 e GRB2/SOS-IRS1. La risposta rapida è caratterizzata da un rapido aumento allo stato stazionario o da un overshoot transitorio seguito dalla condizione di stato stazionario, a seconda dell’assenza/presenza di meccanismi di retroazione che agiscono sulla molecola bersaglio (caso 1 e 2, rispettivamente in blu e verde, in Fig. 3). I meccanismi che costituiscono principalmente la via TSC1/2-mTOR e svolgono un ruolo nella Ser-fosforilazione di IRS1 sono caratterizzati da una risposta relativamente lenta non-overshooting (caso 3, arancione in Fig. 3). Come osservato sopra, la via RAS-MAPK assume nei suoi componenti a monte una risposta rapida, che diventa notevolmente più lenta per quelli a valle (caso 4, viola in Fig. 3).

In generale, le molecole a valle della via, legate a processi relativamente lenti come l’attivazione della trascrizione o l’interazione con l’ambiente esterno alla cellula, come ERK1/2 e GLUT4, sono caratterizzate da una risposta lenta mentre le molecole a monte della via sono caratterizzate da una risposta veloce in modo da suscitare una rapida propagazione del segnale. In questo contesto, la risposta di superamento seguita dal ritorno a uno stato stazionario potrebbe contribuire a ottenere una rapida propagazione del segnale su una via di segnalazione, rendendo le molecole nuovamente disponibili per altre vie di segnalazione immediatamente dopo.

Previsioni del modello in assenza di meccanismi di controllo

Sono state quindi eseguite numerose simulazioni per studiare la robustezza del sistema su due effetti target dell’ISP: traslocazione GLUT4 e fosforilazione ERK1/2. In particolare, è stato analizzato il ruolo di due importanti meccanismi di controllo nella regolazione degli effetti target:

P70S6K-IRS1 anello di feedback negativo (linea rossa in Fig. 1);
ERK1/2-GRB2 / SOS feedback negativo loop (linea blu in Fig. 1);

A tal fine, è stato confrontato il decorso temporale della risposta GLUT4 e ERK1/2 in presenza e assenza dei due meccanismi regolatori sopra elencati (Fig. 4). La dinamica di ERK1 / 2 doppiamente fosforilato è fortemente influenzata sia dai loop di feedback negativi P70S6K-IRS1 che ERK1/2-GRB2/SOS. D’altra parte, lo stato stazionario e il comportamento dinamico del GLUT4 in membrana non sono influenzati da ERK1/2, ma sono fortemente influenzati dal ciclo di feedback negativo P70S6K-IRS1, confermando così la notevole importanza di quest’ultimo meccanismo di controllo nel determinare la dinamica del sistema.

È ben noto che la resistenza all’insulina è associata a difetti nella segnalazione IRS-dipendente, implicando la sua disregolazione nell’inizio e nella progressione della malattia metabolica. Una visione emergente è che la regolazione positiva / negativa dell’IR mediante vie autologhe è sovvertita nella malattia da un aumento delle fosforilazioni basali e di altre serine/treonine temporalmente inappropriate, che portano a una riduzione dell’assorbimento di glucosio. L’iperinsulinemia compensatoria può aumentare a questo punto e portare, in definitiva, al diabete. Sebbene IRS1 (e IRS2) siano regolati attraverso un meccanismo complesso che coinvolge la fosforilazione di più di 50 diversi residui di serina/treonina, nel nostro modello P70S6K-IRS1 il ciclo di feedback negativo sembra essenziale per un buon controllo dell’assorbimento del glucosio. Il miglioramento del ciclo di feedback negativo P70S6K-IRS1 è in grado di spiegare una ridotta sensibilità all’insulina e l’assorbimento del glucosio (Fig. 5). Allo stesso modo (anche se ipotizzano anche un feedback positivo da mTOR a un diverso residuo di serina IRS1), Brännmark et al. , usando un modello minimo di segnalazione dell’insulina, mostrano che un meccanismo di feedback positivo diminuito è in grado di spiegare un assorbimento di glucosio ridotto.

D’altra parte, sia P70S6K-IRS1 e ERK1/2-GRB2/SOS cicli di feedback negativo sembra essenziale per garantire che i doppiamente fosforilata ERK mostra un comportamento transitorio, con un picco a 10 min seguita da un ritorno alle condizione basale. Questo comportamento è già stato riportato in letteratura sotto stimolo insulinico e sotto stimolo del fattore di crescita epidermico . Una risposta transitoria di ERK impedisce un’attivazione sostenuta di ERK che provocherebbe la proliferazione continua delle cellule .

Analisi di sensibilità

Per indagare ulteriormente il ruolo dei due principali meccanismi di controllo nella regolazione degli effetti target, è stata eseguita un’analisi di sensibilità locale applicando una piccola perturbazione (0.1% del valore del parametro) a un parametro del modello alla volta e valutando i cambiamenti relativi risultanti della traslocazione GLUT4 e della fosforilazione ERK1/2 (vedi Metodi). Le tabelle 1 e 2 mostrano i coefficienti di sensibilità dei parametri del modello, classificati in base al loro valore assoluto e confrontati con il valore che i coefficienti assumono al momento della rimozione dei loop di feedback negativo P70S6K-IRS1 e ERK1/2-GRB2/SOS. Questi coefficienti misurano l’effetto complessivo, cioè durante la finestra di osservazione, di una variazione di parametro sul risultato, cioè la risposta GLUT4 e ERK. Valori positivi / negativi significano che l’aumento del valore del parametro ha l’effetto di migliorare/ridurre la risposta. Poiché piccoli valori assoluti significano che le modifiche dei parametri non influenzano in modo significativo il risultato, nelle tabelle 1 e 2, solo coefficiente superiore allo 0,1 % (valore assoluto), nel modello originale o modificato, sono riportati.

Tabella 1 Parametrico analisi di sensibilità del modello completo di GLUT4 la traslocazione di membrana

Tabella 2 Parametrico analisi di sensibilità del modello completo per l’attivazione di ERK1/2

Parametrico analisi di sensibilità del modello completo di GLUT4 risposta rivela che la maggior parte dei parametri sensibili sono relative al GLUT4 traslocazione alla membrana del plasma, seguiti da quelli legati a lipidi formazione e IRS1_PI3K complesso di formazione/dissociazione. L’assenza di feedback p70S6K_IRS1 ha un forte impatto sull’aumento della sensibilità (valore assoluto) dei parametri relativi alla formazione lipidica e alla formazione/dissociazione del complesso IRS1_PI3K.

I parametri relativi alla fosforilazione/defosforilazione IRS1 al basale a Tyr/Ser, hanno una sensibilità inferiore, che diminuisce (valore assoluto), in generale, rimuovendo il feedback P70S6K-IRS1, ad eccezione del parametro k7p, relativo alla fosforilazione IRS1 a Ser. I parametri relativi alla fosforilazione IRS1 mediata da PKC a Ser mostrano anche valori aumentati dopo la rimozione del feedback P70S6K-IRS1. Poiché la rimozione del feedback ERK1/2-GRB2/SOS non ha alcun effetto sulla traslocazione del GLUT4, i coefficienti di sensibilità non cambiano con e senza questo feedback.

L’analisi di sensibilità parametrica del modello completo per la risposta ERK1/2 mostra che i parametri più sensibili sono legati all’attivazione RAS, MEK e RAF e alla fosforilazione IRS1 a Tyr e Ser, quest’ultima mediata da p70S6K.Lungo sia il percorso PI3K-AKT che il percorso RAS-ERK1/2, il feedback ERK1/2-GRB2/SOS sembra avere un ruolo importante sulla robustezza del sistema. La dinamica del sistema è debolmente influenzata dalla sua assenza (vedi Fig. 4), mentre la sensibilità del parametro aumenta (in valore assoluto) in quasi tutti i casi se questo feedback viene rimosso.

Le conclusioni sull’effetto del feedback P70S6K-IRS1 sulla risposta ERK1/2 sono più controverse. La rimozione di questo feedback ha l’effetto di ridurre la sensibilità dei parametri lungo la via PI3K_AKT, mentre, lungo la via RAS-ERK1/2, non ha quasi alcun effetto per i parametri relativi alla fosforilazione MEK, all’inattivazione RAF e alla fosforilazione ERK. Diminuisce la sensibilità per i parametri relativi all’attivazione RAS, RAF e all’interruzione complessa IRS1-GRB2 / SOS e IRS1-SHP2. Aumenta fortemente la sensibilità dei parametri relativi all’attivazione SRC e RAF.

Questi risultati evidenziano il ruolo centrale dei cicli di feedback negativo nel determinare non solo la dinamica di un sistema biologico, ma anche la sua robustezza. Questa proprietà è di notevole importanza perché preserva il comportamento dinamico del sistema contro il rumore e le piccole fluttuazioni biologiche comunemente dovute alla variabilità intercellulare.