Abstract
Ligustrum vicaryi L. è un ibrido di Ligustrum ovalifolium Hassk. var. aureo-marginatum e Ligustrum vulgale L., appartenenti alla famiglia delle Oleaceae. È spesso usato come arbusto ornamentale a causa delle sue foglie dorate. Tuttavia, il suo valore medico deve ancora essere scoperto. Recentemente, i polisaccaridi vegetali hanno attirato l’attenzione completa a causa delle loro proprietà biologiche, comprese le attività immunomodulatorie e antiossidanti. Questo studio mirava ad estrarre, purificare e caratterizzare il polisaccaride dal frutto Ligustrum vicaryi L. e indagare le sue attività immunomodulatorie e antiossidanti. Il polisaccaride di Ligustrum vicaryi L. fruit (LVFP) è stato ottenuto mediante estrazione ad ultrasuoni, precipitazione di etanolo, separazione della resina macroporosa e purificazione del sacchetto di dialisi. Le proprietà fisico-chimiche del LVFP sono state chiarite utilizzando la spettrometria a infrarossi a trasformata di Fourier, la cromatografia ionica ad alte prestazioni e la cromatografia a filtrazione su gel ad alte prestazioni. I risultati hanno indicato che il LVFP consisteva di ramnosio, arabinosio, galattosio e glucosio in un rapporto di 1,79 : 7,55 : 4,58 : 1,54 e il suo peso molecolare era di 88.949 Da. Le attività immunomodulatorie e antiossidanti del LVFP sono state studiate utilizzando un modello murino immunosoppresso indotto da ciclofosfamide (Cy). I risultati hanno dimostrato che il LVFP ha aumentato significativamente gli indici della milza e del timo, ha migliorato la funzione fagocitaria dei neutrofili, ha attivato i linfociti B e T e ha sovraregolato i livelli sierici di IL-10 e TNF-α. Inoltre, abbiamo osservato che il LVFP ha alleviato il danno epatico indotto da Cy aumentando i livelli di superossido dismutasi (SOD) e glutatione perossidasi (GSH-px). Questi risultati hanno suggerito che il LVFP ha le attività immunomodulatorie e antiossidanti, quindi ponendo le basi per l’applicazione del LVFP nelle industrie alimentari farmaceutiche e funzionali.
1. Introduzione
Gli immunomodulatori possono essere utilizzati come strategie preventive o terapeutiche, aumentando o sopprimendo la risposta di difesa dell’ospite. I prodotti naturali con funzioni immunomodulatorie e antiossidanti sono ampiamente usati per trattare diverse malattie, tra cui malattie autoimmuni, disturbi infiammatori e cancro . Recentemente, c’è stato un crescente interesse per prodotti naturali poco costosi e meno tossici rispetto all’uso di agenti chemioterapici sintetici.
Ligustrum vicaryi L. è un ibrido di Ligustrum ovalifolium Hassk. var. aureo-marginatum e Ligustrum vulgale L., appartenenti alla famiglia delle Oleaceae . Presenta un fenotipo senza clorofilla ed è ampiamente usato come arbusto orticolo grazie alle sue foglie dorate. Secondo le caratteristiche di scambio di gas e le risposte di fluorescenza della clorofilla, Ligustrum vicaryi L. può resistere a SO2 e quindi può essere utilizzato per la fitostabilizzazione del suolo contaminato da CD . Sebbene Ligustrum vicaryi L. abbia un alto valore ornamentale e di protezione ambientale, il suo potenziale terapeutico deve ancora essere chiarito.
I polisaccaridi vegetali, una classe di importanti macromolecole biologiche che si trovano comunemente nelle erbe medicinali tradizionali, presentano una gamma di attività biologiche tra cui attività antiossidanti, immunomodulanti, antiaging, antitumorali e antinfiammatorie . Negli ultimi anni, ci sono stati molti studi dedicati all’estrazione e all’analisi di bioattività dei polisaccaridi vegetali. I polisaccaridi della frutta della pianta sono il più comunemente ricercato, compreso i polisaccaridi della giuggiola , i polisaccaridi del cachi ed i polisaccaridi dell’anguria . Per quanto ne sappiamo, non è stato riportato uno studio basato sulla preparazione e sulle bioattività dei polisaccaridi Ligustrum vicaryi L. fruit (LVFPs).
In questo studio, il LVFP è stato estratto e purificato. Successivamente, sono stati analizzati il peso molecolare e la composizione monosaccaridica del LVFP. Inoltre, le funzioni biologiche del LVFP sono state valutate in un modello murino immunosoppresso indotto da ciclofosfamide (Cy). I risultati hanno dimostrato che il LVFP ha capacità immunomodulatorie attivando sia l’immunità innata che quella adattativa. Inoltre, il LVFP ha dimostrato l’attività antiossidante aumentando la superossido dismutasi (SOD) e la glutatione perossidasi (GSH-px). Questo studio ha presentato una base teorica per lo sviluppo del LVFP come rimedio terapeutico alternativo per le malattie immuno-correlate.
2. Materiali e metodi
2.1. Benessere degli animali e dichiarazioni etiche
Tutte le procedure sperimentali sono conformi alle raccomandazioni delle linee guida ARRIVE (animal research: reporting in vivo experiments). Il comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della Jining Medical University ha approvato le procedure. Tutte le procedure sperimentali sono state condotte nel modo più umano possibile. Un totale di topi Kunming maschi sani 100 del peso di 20-25 g sono stati alloggiati in condizioni di mantenimento di 12 h di un ciclo artificiale scuro-chiaro, con cibo e acqua disponibili ad libitum. Gli animali sono stati alloggiati in stanze standard per animali, con una temperatura di 20-22°C e umidità al 55-60%.
2.2. Estrazione e purificazione del polisaccaride
Ligustrum vicaryi L. i frutti sono stati ottenuti dal giardino botanico della Jining Medical University (Rizhao, Shandong, Cina) e identificati da Jianan Wang (Botanico medico, Scuola di Farmacia, Jining Medical University). I frutti di Ligustrum vicaryi L. essiccati sono stati polverizzati e setacciati attraverso un setaccio a 40 maglie. La polvere è stata immersa in acetone (il rapporto tra polvere e acetone era 1 : 3) e agitata per 24 h per rimuovere i lipidi. Il surnatante fu scartato e gli avanzi furono essiccati nel forno. Il polisaccaride è stato estratto con acqua distillata 8: 1 (v / w) a 50°C per 80 min utilizzando una potenza ultrasonica di 250 W. L’estratto d’acqua è stato filtrato usando cotone. Il residuo è stato rimosso dopo centrifugazione a 3000 giri / min per 3 min. Successivamente, il surnatante concentrato è stato precipitato con etanolo al 70% e questo processo è stato ripetuto con etanolo al 95%. Dopo che il surnatante è stato rimosso, è stata aggiunta acqua distillata per sciogliere l’estratto e il residuo è stato rimosso mediante centrifugazione. La resina macroporosa DM101 è stata utilizzata per rimuovere il pigmento. Il reagente di Sevage (cloroformio / 1-butanolo, v / v = 4 : 1) è stato utilizzato per rimuovere la proteina fino a quando non è stata osservata alcuna reazione di decolorazione utilizzando Coomassie Brilliant Blue G-250 detection. I polisaccaridi sono stati posti in un essiccatore di congelamento per 24 h per ottenere la polvere congelata. Le piccole molecole nel polisaccaride sono state rimosse utilizzando una sacca per dialisi (taglio molecolare di 3500 Da) per due giorni e l’acqua distillata è stata sostituita ogni 12 h. La cromatografia a colonna Sephadex G-200 è stata utilizzata per purificare il LVFP. Il test dell’acido antrone-solforico, con una curva standard di glucosio, è stato utilizzato per determinare la purezza del LVFP.
2.3. Analisi infrarossa della trasformata di Fourier (FTIR)
Il LVFP è stato mescolato con la polvere pura del bromuro di potassio e la miscela è stata disposta in una malta dell’agata e macinata uniformemente sotto una lampada infrarossa. La miscela è stata valutata utilizzando lo spettrometro infrarosso a trasformata di Fourier IRTracer-100 (Shimadzu, Giappone).
2.4. Cromatografia ionica ad alte prestazioni (HPIC)
Per l’analisi HPIC, 5 mg di LVFP sono stati sciolti in 1 ml di acido trifluoroacetico 2 mol/L e posti a 121°C per 2 h per l’idrolisi. Quindi, la miscela è stata filtrata utilizzando una membrana di filtrazione microporosa da 0,45 µm. La separazione cromatografica dei monosaccaridi è stata eseguita sul cromatografo ionico ICS-5000 dotato di una colonna CarboPac PA20 e di un rilevatore di ampere a impulsi. Le condizioni di separazione per cromatografia ionica sono state regolate e testate per una miscela di otto standard di monosaccaridi (fucosio, ramnosio, arabinosio, galattosio, glucosio, xilosio, mannosio e fruttosio). Una separazione superiore è stata ottenuta per eluizione a gradiente con una portata costante di 0,5 mL / min. La fase mobile consisteva in 250 mm di NaOH (A), acqua (contenente 1 M di NaAc%, v/v, B) e acqua (C). L’eluizione è stata effettuata come segue: 2.0% A a 0 min 21 min; 2.0% A e 5.0% B a 21.1 min; 2.0% A e 20% B a 21.1 min 30 min; e 80% A a 30.1 min 50 min.
2.5. Cromatografia ad alte prestazioni per filtrazione in gel (HPGFC)
La massa molecolare del polisaccaride è stata analizzata da HPGFC (Waters, New York, USA) e dotata del RID (2414 refractive index detector) e della workstation Empower 3. Le condizioni cromatografiche erano le seguenti: colonna cromatografica: Ultrahydrogel ™ Lineare, 300 mm × 7,8 mm × 2, fase mobile: 0,1 M NaNO3, portata: 0,9 mL / min e temperatura della colonna: 45°C. Il campione è stato disciolto nella fase liquida e filtrato da una membrana di filtrazione microporosa. Gli standard di peso molecolare utilizzati per la curva di calibrazione erano MW135350, MW36800, MW9750, MW2700 e MW180.
2.6. Ciclofosfamide – (Cy -) indotta immunosoppressiva Modello murino e somministrazione LVFP
Un totale di 100 topi sono stati suddivisi casualmente in cinque gruppi: controllo, Cy, Cy + LVFP (100 mg/kg/die), Cy + LVFP (200 mg/kg/die), e Cy + LVFP (400 mg/kg/die). Al gruppo di controllo è stata somministrata soluzione salina normale e agli altri quattro gruppi è stata iniettata per via intraperitoneale Cy (40 mg/kg) ogni giorno per sette giorni. La LVFP è stata somministrata per somministrazione intragastrica per sette giorni consecutivi.
2.7. Determinazione degli indici di milza e timo
Tutti i topi sono stati pesati e sacrificati 24 h dopo l’ultima somministrazione del farmaco. La milza e il timo sono stati asportati e pesati. L’indice della milza o del timo è stato espresso come il rapporto tra il peso della milza o del timo e il peso corporeo.
2.8. Determinazione della funzione fagocitaria dei neutrofili di topo
Staphylococcus aureus è stato utilizzato per valutare la fagocitosi dei neutrofili. In breve, 40 µL di sangue sono stati ottenuti da topi dopo la somministrazione di LVFP e posti in un tubo di eparina per prevenire la coagulazione. Successivamente, 40 µL di sospensione batterica sono stati aggiunti al tubo sopra menzionato. La miscela è stata uniformemente rivestita su vetrini e mantenuta a temperatura ambiente per 0,5 h. Quindi, la miscela è stata fissata con 2-3 gocce di metanolo per 5 min e macchiata con 4-5 gocce di macchia di Wright per 5 min. Sono stati osservati e registrati un totale di 100 neutrofili. Il tasso fagocitario dei neutrofili e l’indice fagocitario dei neutrofili sono stati calcolati come segue: il tasso fagocitario dei neutrofili = il numero di neutrofili che hanno mostrato funzione fagocitaria/il numero totale di neutrofili e l’indice fagocitario dei neutrofili = il numero totale di batteri che erano stati inghiottiti dai neutrofili/il numero totale di neutrofili.
2.9. Determinazione dell’emolisina sierica mediante ELISA
Il quarto giorno, il 5% di una sospensione di globuli rossi di pollo (CRBC) è stato iniettato per via intraperitoneale nei topi (0,1 mL/10 g). Il settimo giorno, 2 h dopo la somministrazione di LVFP, è stato ottenuto 1 mL di sangue di topi e centrifugato per 10 min. Quindi, 40 µL di siero sono stati aggiunti a 2 ml di soluzione salina normale. Al siero sono stati aggiunti un ml 10% di siero di cavia e 1 ml 5% di sospensione CRBC, seguita da incubazione a bagnomaria a 37°C per 0,5 h. La miscela è stata centrifugata e il surnatante è stato posto in una piastra di coltura a 96 pozzetti. Il corrispondente valore di densità ottica è stato rilevato dallo strumento Thermo Scientific Multiskan MK3 Enzyme Mark (Waltham, MA, USA).
2.10. Determinazione del tasso di trasformazione dei linfociti T
Il secondo giorno, i topi sono stati iniettati per via intramuscolare 8 mg/kg di fitoemagglutinina (PHA). Il settimo giorno, 2 h dopo la somministrazione di LVFP, 40 µL di sangue sono stati raccolti dal seno retroorbitale, posti su un vetrino e macchiati con gocce 4-5 della macchia di Wright. Il colorante in eccesso è stato risciacquato con acqua dopo 20 min. Utilizzando un microscopio, sono state osservate 100 cellule. I linfociti trasformati sono stati calcolati come segue: tasso di trasformazione dei linfociti = linfociti trasformati / numero totale di linfociti.
2.11. La risposta di ipersensibilità di tipo ritardato (DTH)
La risposta DTH è stata esaminata in base al grado di gonfiore dell’orecchio. Generalmente, si ritiene che il grado di gonfiore dell’orecchio rifletta il grado di infiammazione . La risposta DTH è stata misurata come segue: Il secondo giorno, 1 cm2 di peli addominali è stato rimosso usando Na2S e la pelle addominale è stata coperta con 25 µL di soluzione di 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB). Il sesto giorno, la pelle dell’orecchio destro è stata rivestita con 20 µL di soluzione DNFB. Il settimo giorno, 2 h dopo la somministrazione di LVFP, i topi sono stati sacrificati e le due orecchie sono state asportate e pesate. La differenza di peso tra le due orecchie ha determinato il grado di gonfiore dell’orecchio.
2.12. Rilevazione di TNF-α e IL-10 citochine nel siero
Il settimo giorno, 2 h dopo la somministrazione di LVFP, il sangue dei topi è stato ottenuto utilizzando una puntura sinusale retroorbitale e coagulato naturalmente per 15 min a temperatura ambiente. Successivamente, il sangue è stato centrifugato per 20 min e il surnatante è stato raccolto. TNF-α e IL-10 nel surnatante sono stati rilevati utilizzando kit ELISA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Cina).
2.13. Rilevamento di superossido dismutasi (SOD), glutatione perossidasi (GSH-Px) e livelli di aldeide dicarbossilica di metano (MDA)
L’ottavo giorno, i topi sono stati sacrificati e i fegati sono stati estratti. Dopo la macinazione e la centrifugazione, il surnatante del tessuto epatico è stato raccolto per la rilevazione di SOD, GSH-px e MDA. SOD, GSH-px e MDA sono stati misurati utilizzando kit ELISA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Cina).
2.14. Ematossilina ed eosina (HE) Colorazione
colorazione HE è stata eseguita come riportato in precedenza . L’ottavo giorno, i topi sono stati sacrificati e i tessuti epatici sono stati estratti e fissati in formalina tamponata neutra al 10%. Dopo l’incorporamento in paraffina, i tessuti sono stati tagliati in sezioni da 5 µm. Quindi, le diapositive sono state macchiate con LUI per determinare i cambiamenti morfologici. Le immagini sono state fotografate al microscopio ottico (Olympus, Tokyo, Giappone).
2.15. Analisi statistica
Soggetti/preparati sperimentali sono stati assegnati in modo casuale a gruppi e sono state ottenute dimensioni di gruppo uguali. Le assegnazioni di gruppo, la registrazione dei dati e l’analisi dei dati non sono state divulgate allo sperimentatore. I dati sono mostrati come media ± SD da almeno cinque esperimenti indipendenti. ANOVA a senso unico accompagnata dal test di confronti multipli di Tukey è stata utilizzata per confronti multipli utilizzando GraphPad Prism versione 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) ed è stata considerata statisticamente significativa.
3. Risultati
3.1. Analisi dello spettro FTIR di LVFP
Il LVFP è stato estratto mediante rimozione lipidica tramite acetone, acqua calda combinata con estrazione ad ultrasuoni, precipitazione di etanolo, rimozione del pigmento mediante resina macroporosa, deproteinizzazione con il reagente Sevage e rimozione di piccole molecole mediante una sacca per dialisi, rispettivamente. Inoltre, la nuova struttura polisaccaridica è stata caratterizzata dalla spettroscopia infrarossa. L’analisi dello spettro FTIR del LVFP è mostrata nella Figura 1 (a). Il caratteristico picco ampio a 3345 cm-1 corrispondeva alla vibrazione di allungamento OH (forse inclusa NH). Il picco di assorbimento a 2929 cm−1 corrispondeva al picco di assorbimento delle vibrazioni di allungamento CH e al picco di assorbimento dello zucchero. L’assorbimento a 1599 cm-1 indicava i modi di vibrazione di flessione di-OH. Il picco a 1412 cm-1 è risultato dalla presenza di vibrazioni di flessione C-H. Inoltre, gli assorbimenti a 1073 cm-1 indicavano i modi di vibrazione di flessione dello stiramento C-O nella forma del gruppo idrossilico alcolico.
3.2. Composizione del monosaccaride di LVFP
Le composizioni del monosaccaride del LVFP sono state analizzate da HPIC. Come mostrato nelle figure 1(b) e 1 (c), tutti i monosaccaridi esistenti nei polisaccaridi sono stati identificati in base al tempo di eluizione degli standard monosaccaridi, con riferimento a una curva standard. Il LVFP era composto principalmente da ramnosio, arabinosio, galattosio e glucosio nel rapporto molare di 1,79 : 7,55 : 4,58 : 1,54.
3.3. Determinazione del peso molecolare di LVFP da HPGFC
Il peso molecolare del LVFP è stato rilevato da HPGFC. Destrani (peso molecolare: 180, 2700, 9750, 368000 e 135350 Da) sono stati utilizzati come standard poiché sono solubili in acqua e disponibili in un’ampia gamma di masse molecolari. Gli standard fornivano linee guida sulla stima delle dimensioni del LVFP. È stata ottenuta una curva standard (y = -0,523 x + 13,01, R2 = 0,995). I risultati hanno dimostrato che il peso molecolare del LVFP era di 88.949 Da.
3.4. Effetti di LVFP sugli indici del timo e della milza in topi immunosoppressori indotti da Cy
Il modello di topo immunosoppresso indotto da Cy è stato stabilito per studiare l’attività immunomodulatoria del LVFP. Cy è stato somministrato come iniezione intraperitoneale (40 mg/kg) ogni giorno per sette giorni. Dopo cinque giorni di somministrazione di Cy, i topi hanno mostrato sintomi come perdita di capelli, bassa eccitazione, aggressività, scarso appetito e perdita di peso, mentre non è stato osservato alcun cambiamento evidente nel gruppo di controllo, indicando che il modello animale è stato stabilito con successo. Ai gruppi Cy + LVFP sono state somministrate diverse concentrazioni di LVFP (100, 200 e 400 mg/kg/die) per sette giorni consecutivi. Gli indici della milza e del timo riflettono le funzioni immunitarie dell’organismo . Gli effetti LVFP sugli indici del timo e della milza nei topi immunosoppressivi indotti da Cy sono mostrati nella Figura 2. Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo Cy ha mostrato una significativa diminuzione degli indici del timo e della milza. La somministrazione di LVFP ha aumentato significativamente questi indici in modo dose-dipendente. Questi risultati hanno suggerito che il LVFP potrebbe influenzare gli organi immunitari per migliorare l’immunità.
(a)
(b)
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3.5. Effetti di LVFP sulla fagocitosi dei neutrofili nei topi immunosoppressori indotti da Cy
I neutrofili sono una difesa efficace contro i microrganismi invasori . La fagocitosi è una strategia chiave per i neutrofili nell’uccidere gli agenti patogeni . Il tasso fagocitico e l’indice fagocitico sono stati esaminati per studiare l’attivazione dei neutrofili . Come mostrato nella Figura 3, rispetto al gruppo di controllo, il gruppo Cy aveva ridotto significativamente la velocità fagocitaria e l’indice fagocitario, suggerendo uno stato immunosoppressivo. La somministrazione di LVFP (200 mg/kg e 400 mg/kg) ha alleviato significativamente questi cambiamenti. Questi risultati hanno suggerito che il LVFP può migliorare la funzione fagocitaria dei neutrofili.
(a)
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3.6. Effetti di LVFP sull’immunità umorale e sull’immunità cellulare nei topi immunosoppressivi indotti da Cy
L’immunità umorale è fondamentale per il corpo per combattere i tumori e le infezioni. Il livello di emolisina sierica può essere utilizzato per valutare la risposta immunitaria umorale . L’emolisina sierica è diminuita con il trattamento con Cy e questa variazione è stata attenuata significativamente dalla LVFP in modo dose-dipendente(Figura 4 (a)). Una varietà di antigeni dal sangue può attivare i linfociti T. PHA può agire come un mitogeno per innescare l’attivazione e la proliferazione delle cellule T. Il test di trasformazione dei linfociti T è stato eseguito utilizzando sangue di topo dopo stimolazione PHA in presenza o assenza di LVFP. Come mostrato nella Figura 4(b), tutte e tre le dosi di LVFP hanno notevolmente inibito la riduzione indotta da Cy del tasso di trasformazione dei linfociti T. La risposta DTH è una risposta immunitaria mediata dalle cellule T. La risposta DTH è stata valutata misurando il grado di gonfiore dell’orecchio. Tutte e tre le dosi del LVFP hanno marcatamente attenuato l’inibizione indotta da Cy nel grado di gonfiore dell’orecchio(Figura 4 (c)). Questi risultati hanno suggerito che il LVFP può attivare i linfociti B e T.
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3.7. Effetti di LVFP sull’espressione di IL-10 e TNF-α nel siero di topi immunosoppressivi indotti da Cy
Le citochine secrete dalle cellule immunitarie svolgono ruoli vitali nella difesa dell’ospite . IL-10 e TNF-α sono mediatori infiammatori chiave . ELISA è stata eseguita per accertare gli effetti del LVFP sull’espressione sierica di IL-10 e TNF-α. I nostri risultati hanno dimostrato che le espressioni IL-10 e TNF-α, dopo il trattamento con Cy, erano significativamente diminuite. La somministrazione di LVFP ha aumentato in modo dose-dipendente i livelli di IL-10 e TNF-α (Figura 5).
(a)
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3.8. Effetti di LVFP sullo stress ossidativo nei topi immunosoppressivi indotti da Cy
Inoltre, questo studio ha studiato se il LVFP ha alleviato lo stress ossidativo indotto da Cy e il danno epatico. SOD converte l’anione superossido in H2O2 e O2 per prevenire e neutralizzare il danno indotto dai radicali liberi . Si presume che GSH-px sia un’importante difesa endogena contro la distruzione perossidativa della membrana cellulare . MDA è il prodotto finale della perossidazione lipidica e può riflettere il danno ossidativo nel tessuto epatico . Le figure 6 (a) -6 (c) dimostrano la significativa diminuzione delle espressioni SOD e GSH-px, con un aumento dei livelli di MDA nel tessuto epatico dopo il trattamento con Cy. La somministrazione del LVFP dose-dipendente ha aumentato i livelli di SOD e GSH-px e diminuito il livello di MDA. Successivamente, i cambiamenti nella morfologia del fegato sono stati valutati usando la colorazione HE. Come mostrato nella Figura 6 (d), nel gruppo Cy, le cellule epatiche erano sparse e disordinate con il nucleo picnotico. Le sinusoidi epatiche erano piene di globuli rossi. Come previsto, le cellule epatiche del gruppo LVFP sono state disposte in modo ordinato con un nucleolo chiaro, paragonabile a quelli del gruppo di controllo. I risultati hanno indicato che il LVFP potrebbe attenuare lo stress ossidativo e il danno epatico indotto da Cy.
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d)
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c)
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4. Discussione
In questo studio, un polisaccaride è stato estratto dal frutto Ligustrum vicaryi L. e sono state valutate le sue attività immunomodulatorie e antiossidanti. Il polisaccaride è stato estratto con acqua calda combinata con estrazione ad ultrasuoni, precipitazione di etanolo, rimozione del grasso mediante acetone, rimozione del pigmento mediante resina macroporosa DM101, deproteinizzazione con il reagente Sevage (cloroformio/1-butanolo, v/v = 4 : 1) e rimozione di piccole molecole utilizzando la sacca per dialisi, rispettivamente. Inoltre, questa struttura polisaccaridica è stata caratterizzata da spettroscopia infrarossa, HPGFC-RID e HPIC. I risultati hanno indicato che il peso molecolare del LVFP è di 88.949 Da e il LVFP è costituito da quattro monosaccaridi, vale a dire ramnosio, arabinosio, galattosio e glucosio nel rapporto molare di 1,79 : 7,55 : 4,58 : 1,54.
L’immunosoppressione è uno stato di disfunzione immunitaria temporanea o permanente e può rendere un organismo più sensibile agli agenti patogeni. Lo sviluppo di nuovi agenti immunomodulatori è uno dei metodi più efficaci per la prevenzione e il trattamento delle malattie immunosoppressive . Ad esempio, gli agenti immunomodulatori combinati con farmaci chemioterapici sembrano essere utili nella terapia del cancro . Diversi rapporti hanno indicato correlazioni positive tra le azioni immunomodulatorie e polisaccaridi. Ayeka et al. dimostrato che la liquirizia (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) il polisaccaride ha effetti immunomodulatori evidenti attraverso l’attivazione delle popolazioni di cellule immunitarie CD4+ e CD8+ e l’aumento della produzione di varie citochine, come IL-2, IL-6 e IL-7 . Chen et al. polisaccaridi isolati da Schisandra sphenanthera e Schisandra chinensis; questi estratti potrebbero migliorare l’attività fagocitaria dei macrofagi e migliorare l’immunità del corpo . Secondo quanto riferito, è stato osservato che i polisaccaridi di Schisandra sphenanthera e Schisandra chinensis erano principalmente composti da arabinosio, glucosio e galattosio, simili alla composizione del LVFP. Per indagare se il LVFP possedesse funzioni immunomodulatorie, è stato stabilito un modello di topo immunosoppresso indotto da Cy. Cy è un agente chemioterapico ed è stato utilizzato per stabilire modelli animali immunosoppressivi . A livello degli organi immunitari, i risultati hanno indicato che il LVFP ha aumentato significativamente gli indici di milza e timo nei topi immunosoppressori indotti da Cy. A livello delle cellule immunitarie, è stato osservato che il LVFP ha migliorato la funzione fagocitaria dei neutrofili e ha promosso l’attivazione dei linfociti B e T. Questi dati indicano che il LVFP può migliorare sia l’immunità innata che quella adattativa.
Inoltre, sono state esaminate anche citochine immuno-correlate nel siero e i risultati hanno indicato che la LVFP ha aumentato i livelli di IL-10 e TNF-α. Secondo quanto riferito, diversi tipi di polisaccaridi possono influenzare l’espressione di fattori infiammatori. Chen et al. osservato che polisaccaridi solfati da microalghe filamentose Tribonema sp. può migliorare le espressioni IL-6, IL-10 e TNF-α nei macrofagi . Cheng et al. ha riferito che i polisaccaridi del Lactarius deliciosus selvatico hanno aumentato la secrezione di TNF-α, IL-1β e IL-6 nei macrofagi . Wang et al. ha riferito che il polisaccaride dal lichene Umbilicaria esculenta ha indotto il rilascio di TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6 e IL-10 nei macrofagi murini .
Gli antiossidanti sono sostanze che sopprimono l’ossidazione nel corpo umano. Di solito, c’è un equilibrio tra la produzione reattiva di specie di ossigeno e il sistema di difesa antiossidante, che è indispensabile nel normale metabolismo. Le cellule producono alcuni antiossidanti endogeni come SOD e GSH-px per sopprimere i radicali liberi eccessivi . Questo studio ha determinato l’attività antiossidante del LVFP nei topi immunosoppressori indotti da Cy. I risultati hanno dimostrato che il LVFP ha mostrato un aumento significativo delle espressioni SOD e GSH-px. Inoltre, la LVFP ha ridotto l’espressione di MDA, che è indicativa di danno ossidativo nel fegato. La colorazione ha indicato che il LVFP può alleviare il danno delle cellule epatiche indotto da Cy. Pertanto, si può concludere che il LVFP potrebbe proteggere le cellule dal danno indotto dallo stress ossidativo migliorando la produzione di antiossidanti come SOD e GSH-px. Precedenti ricerche hanno dimostrato che il contenuto di ramnosio, arabinosio e galattosio nella composizione del monosaccaride può influenzare l’attività antiossidante . Il contenuto di ramnosio, arabinosio e galattosio nel LVFP è più alto, che può essere importante per la più forte attività antiossidante dimostrata dal LVFP.
Nel complesso, sono stati estratti polisaccaridi dal frutto Ligustrum vicaryi L. e sono state studiate le loro caratteristiche fisiche e biologiche. Il LVFP potrebbe essere esplorato come un potenziale agente immunomodulante e antiossidante per uso terapeutico nelle malattie immunosoppressive, consentendo l’introduzione della medicina tradizionale cinese sul mercato internazionale.
5. Conclusioni
In conclusione, il LVFP è stato estratto e purificato dal frutto Ligustrum vicaryi L. con un peso molecolare di 88.949 Da e consisteva in quattro monosaccaridi, vale a dire ramnosio, arabinosio, galattosio e glucosio. Studi farmacologici preliminari hanno indicato che il LVFP potrebbe effettivamente migliorare le funzioni immunitarie e aveva attività antiossidante. Questo studio dimostra che il LVFP può essere un promettente agente immunomodulatore e antiossidante per le terapie farmaceutiche (Figura 7).
Disponibilità dei dati
I dati TIF utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.
Riconoscimenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (81800399), il Jining Università di medicina di Dottorato di Ricerca di Avvio del fondo, il Fondo a Livello Nazionale Studenti universitari per l’Innovazione e l’Imprenditorialità del Progetto di Formazione (201610443011), provincia dello Shandong, la Medicina Tradizionale Cinese della Scienza e della Tecnologia Development Program (2019-0450), e il Jining Medica Studente Universitario di Formazione per l’Innovazione Programma (cx2016011/cx2019092).