2.4.3.1 Ruolo di Biocidi in AMR Acquisizione e la Diffusione
Biocidi, che possono essere definiti come sostanze attive e i preparati contenenti uno o più composti attivi destinati a inattivare o esercitare altro effetto di controllo su di microrganismi dannosi, sono ampiamente utilizzati per il mantenimento dei necessari livelli di igiene allevamenti, macelli, e alimentari locali . Nelle fattorie, vengono utilizzati per la pulizia e la disinfezione delle aree associate agli animali da allevamento, tra cui edifici agricoli, letti, attrezzature, bagni di stivale e veicoli di trasporto, tra gli altri. Inoltre, una serie di biocidi sono abitualmente utilizzati nei macelli e nelle aree di produzione e lavorazione alimentare per la disinfezione di attrezzature e superfici al fine di controllare la colonizzazione da parte di microrganismi potenzialmente pericolosi. Some of the most widely used biocides are alcohols, aldehydes, chlorine, and chlorine- releasing agents (sodium hypochlorite, chlorhexidine), iodine, peroxygen compounds (hydrogen peroxide, peracetic acid), phenolic type compounds, quaternary ammonium compounds (benzalkonium chloride), bases (sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate), and acids (mineral and organic acids).
I biocidi sono generalmente impiegati nelle aziende agricole, nei macelli e nelle industrie alimentari a concentrazioni ben superiori alle concentrazioni inibitorie minime (MIC) di tutti i principali microrganismi bersaglio e dovrebbero pertanto essere in grado di garantire l’inattivazione microbica ed evitare lo sviluppo di resistenza ai biocidi. Tuttavia, concentrazioni di biocidi non ottimali si verificano in nicchie selezionate (ad esempio, sotto oggetti o in crepe e fessure e altri siti di approdo) o come conseguenza di un uso improprio. La presenza di materia organica (nota per inattivare alcuni biocidi come i composti clorurati) può ridurne l’efficacia, mentre una formulazione errata, una conservazione inadeguata delle formulazioni e una distribuzione inadeguata del composto su superfici e attrezzature possono causare una diminuzione della concentrazione di biocidi attivi in alcune posizioni nei locali . Nicchie con basse concentrazioni di biocidi possono verificarsi anche attraverso il risciacquo di aree frequentemente pulite e disinfettate o attraverso l’applicazione di biocidi su superfici bagnate, con conseguente diluizione del composto a concentrazioni che possono essere subletali per microrganismi. Inoltre, le linee di smaltimento delle acque reflue possono fornire un contatto permanente di microrganismi con basse concentrazioni di biocidi. Ad esempio, concentrazioni sub-letali di composti rappresentativi di ammonio quaternario come composti di dialchildimetilammonio e cloruri di benzalconio sono state identificate nei sedimenti fluviali (26 e 1.5 ppm, rispettivamente) e acque reflue dagli ospedali (1,5-4 ppm) . Lo stesso vale probabilmente per le acque reflue provenienti da aziende agricole, macelli e impianti di trasformazione alimentare. Pertanto, le comunità microbiche che colonizzano gli ambienti all’interno di aziende agricole, macelli e impianti di produzione alimentare (compresi gli ambienti a contatto con gli alimenti) sono ripetutamente esposte a concentrazioni di biocidi subinibitori e ciò può avere un impatto sull’ecologia microbica e sulla sicurezza alimentare.
La selezione di microrganismi resistenti ai biocidi mediante esposizione a concentrazioni di biocidi non ottimali è stata descritta per alcuni composti biocidi e specie microbiche (ad esempio, Li. monocytogenes-composti di ammonio quaternario, ipoclorito di sodio; Salmonella Typhimurium—triclosan; E. coli—fosfato trisodico, nitrito di sodio, ipocloruro di sodio) . La resistenza ai biocidi rappresenta un problema potenzialmente importante per la salute pubblica in quanto può contribuire ad aumentare la persistenza di microrganismi patogeni e di deterioramento nella catena alimentare. La persistenza batterica, che può essere definita come la sopravvivenza per lunghi periodi di tempo in un determinato luogo è una grande preoccupazione per le industrie alimentari poiché può portare alla ripetuta contaminazione degli alimenti con deterioramento o microrganismi patogeni, incidendo seriamente sulla salute dei consumatori e causando grandi perdite economiche alle imprese alimentari. Un buon esempio di associazione tra persistenza e resistenza ai biocidi è il caso del ceppo Li. monocytogenes 6179. Listeria monocytogenes 6179 è un ceppo sierotipo 1 / 2a, isolato presso il Teagasc Food Research Centre (Irlanda) da ambienti particolari in un impianto di lavorazione del formaggio ripetutamente per un periodo di 12 anni . Il sequenziamento del genoma di Li. monocytogenes 6179 ha permesso l’identificazione di un nuovo trasposone, Tn6188, che comprendeva tre geni trasposasi consecutivi (tnpABC), un gene qacH che codifica un piccolo trasportatore della famiglia di proteine a resistenza multipla (SMR) responsabile dell’esportazione di composti di ammonio quaternario e un presunto regolatore trascrizionale della famiglia tetR a monte del trasportatore . Le indagini hanno anche dimostrato che l’esposizione al benzalconio cloruro (BAC) ha causato un aumento dell’espressione di qacH e che un ceppo mutante della delezione di qacH aveva una tolleranza al BAC inferiore rispetto al ceppo wild type. Recenti studi condotti anche in Irlanda hanno identificato vari ceppi persistenti indistinguibili da Li. monocytogenes 6179 mediante analisi elettroforesi su gel a campo pulsato che sono stati isolati in modo ricorrente da ambienti e alimenti di cinque diverse industrie ittiche durante il 2013 e il 2014. Tutti questi ceppi ospitavano il trasposone Tn6188 e avevano MIC significativamente più alto contro BAC rispetto ad altri ceppi isolati durante lo stesso periodo di tempo e privi del trasposone Tn6188 . Isolati batterici come questi, che portano determinanti di resistenza ai biocidi, persistono negli ambienti industriali per lunghi periodi di tempo e sono una probabile fonte di eventi di contaminazione alimentare.
Recentemente è sorto anche il sospetto che l’esposizione a concentrazioni subottimali di biocidi possa selezionare una maggiore resistenza agli antibiotici clinicamente rilevanti. Alcuni studi condotti nell’ultimo decennio confrontando biocidi e resistenza agli antibiotici di raccolte di ceppi provenienti dai principali agenti patogeni di origine alimentare hanno rivelato una correlazione tra resistenza a entrambi gli agenti . Sfortunatamente, i piccoli set di dati utilizzati e la mancanza di analisi statistiche appropriate hanno limitato i risultati di questi studi. Più recentemente, Coelho et al. effettuato un elegante studio utilizzando metodologie di apprendimento automatico per analizzare la suscettibilità agli antibiotici e biocidi della più grande collezione di isolati finora testati a questo scopo (1632 isolati), in questo caso da St. aureus. They described that reduced susceptibility to two biocides, clorhexidine and BAC, which belong to different structural families, was associated with resistance to several antibiotics (amoxicillin/clavulanate, cefuroxime, cefaclor, cefpodoxime, clindamycin, erythromycin, clarithromycin, azithromycin, telithromycin, ciprofloxacin, levofloxacin, gatifloxacin, and moxifloxacin). Other authors isolated stable mutant strains with increased resistance to one or several antibiotics after exposure to sublethal biocide concentrations. For instance, Langsrud et al. ha riferito che la coltivazione seriale di due ceppi di E. coli in presenza di concentrazioni subinibitorie di BAC ha comportato una maggiore resistenza a vari antibiotici (ampicillina, penicillina G, norfloxacina, acido nalidixico, kanamicina, gentamicina, cloramfenicolo, tetraciclina ed eritromicina), con valori MIC 1,5–20 volte superiori a quelli osservati per le colture di controllo. Randall et al. ha descritto che l’esposizione a un disinfettante a base di aldeide ha dato origine a mutanti di S. Typhimurium con una ridotta suscettibilità alla ciprofloxacina in vari ceppi batterici. Karatzas et al. , in seguito a trattamento prolungato di S. Typhimurium con tre ampiamente utilizzato farm disinfettanti (una miscela di composti ossidanti; di ammonio quaternario disinfettanti contenenti formaldeide e glutaraldeide; e un biocida composto di acidi organici, tensioattivi), ottenuto uno stabile singoli variante da ogni trattamento che esposto ridotta suscettibilità a una gamma di antibiotici (ciprofloxacina, cloramfenicolo, tetraciclina, e ampicillina). Whitehead et al. isolati due mutanti di S. Typhimurium dopo una singola esposizione a concentrazioni in uso di due biocidi (una miscela di aldeidi e composti di ammonio quaternario e un composto di ammina terziaria alogenata) che avevano un’ampia ridotta suscettibilità all’acido nalidixico, al cloramfenicolo, alla tetraciclina e alla ciprofloxacina. Webber et al. ha dimostrato che quattro diversi biocidi (una miscela di aldeidi e composti di ammonio quaternario, un composto di ammonio quaternario, un composto ossidativo e un composto di ammina terziaria alogenata) hanno selezionato mutanti multiresistenti S. Typhimurium con ridotta suscettibilità agli antibiotici.
Non è completamente noto come l’esposizione ai composti biocidi selezioni per una maggiore resistenza agli antibiotici, ma sono postulati due meccanismi, resistenza crociata e coresistenza. Poiché alcuni biocidi e antibiotici condividono gli stessi obiettivi cellulari, è probabile che alcuni determinanti della resistenza ai biocidi e mutazioni vantaggiose che portano ad una maggiore resistenza ai biocidi possano anche essere responsabili dell’acquisizione di resistenza agli antibiotici nelle popolazioni microbiche. Ad esempio, alcune pompe di efflusso multifarmaco, che hanno più di un substrato che potrebbe essere chimicamente non correlato tra loro, possono conferire resistenza simultanea agli antibiotici e ai biocidi quando sono sovraespressi . Questo è noto come resistenza crociata. Inoltre, anche per i biocidi che non condividono un obiettivo con antibiotici, ridotta sensibilità agli antibiotici può essere dovuto al trasferimento orizzontale dei diversi determinanti di resistenza (determinanti di resistenza agli antibiotici e biocidi determinanti di resistenza) associati tra comuni elementi genetici come plasmidi, fagi, integrons, o trasposoni, che può diffondersi ad altri ceppi, specie o generi . Questo è noto come coresistance. Un esempio di questo fenomeno sono gli integroni di classe 1, che sono noti per contenere una vasta gamma di cassette geniche tra cui alcune resistenze di codifica a diversi antibiotici e composti di ammonio quaternario. In effetti, l’esistenza di serbatoi ambientali di integroni di classe 1 è nota da tempo e il gene integron-integrasi di classe 1 intI1 è stato recentemente proposto come biomarcatore delle pressioni selettive imposte dall’inquinamento antropogenico . I microrganismi (compresi quelli non patogeni e inculturabili) presenti negli alimenti e negli ambienti correlati agli alimenti possono svolgere un ruolo importante negli eventi di coresistenza. In effetti, sono buoni serbatoi di geni di resistenza antimicrobica (AMR) e possono essere facilitatori per la diffusione del gene AMR in vari ecosistemi ambientali, compresi gli ecosistemi alimentari .