Fattori che si legano al promotore prossimale pro-COL1A2
Diversi elementi funzionali cis-acting sono stati identificati nel promotore prossimale di circa 400 bp del gene pro-Col1a2 del topo (154-2350 bp) e nella sequenza minima umana tra 152 e 2378 bp. Il primo fattore di trascrizione trovato per legare a questo promotore era la proteina CCAAT-legante CBF onnipresente. Questo fattore di trascrizione è formato da tre subunità separate, denominate A, B e C, che sono state tutte clonate e sequenziate (Maity e de Crombrugghe, 1998). Tutte e tre le subunità sono necessarie affinché CBF si leghi alla sequenza contenente la scatola CCAAT situata tra 284 e 280 e attivi la trascrizione sia nei geni umani che nei topi (vedi Fig. 13.2 B). I dati in vitro suggeriscono che le subunità A e C si associano per formare un complesso A-C e che questo complesso forma quindi una molecola eteromerica con la subunità B (Sinha et al., 1995). Mutazioni nella scatola CCAAT che impediscono il legame di CBF diminuiscono l’attività trascrizionale del promotore prossimale pro-Col1a2 da tre a cinque volte in esperimenti di trasfezione transitoria di linee cellulari fibroblastiche (Coutry et al., 1995). Il CBF purificato e il CBF composto dalle sue tre subunità ricombinanti attivano anche il promotore pro-Col1a2 in estratti nucleari senza cellule precedentemente esauriti di CBF (Coutry et al., 1995). Due delle tre subunità di CBF contengono domini di attivazione trascrizionale. Più recentemente, una singola sostituzione di T ad un A in vivo in presenza di un potenziatore a monte della sequenza umana ha suggerito che CBF è coinvolto nella modellatura dell’espressione del collagene di tipo I nell’asse dorsoventrale e rostrocaudale dei fibroblasti della pelle del topo (Tanaka et al., 2004).
Oltre al sito di legame per CBF, esperimenti di footprinting e studi di gel-shift hanno identificato altri siti di legame nei primi 350 bp del promotore pro-Col1a2 del topo. Tre sequenze ricche di GC, situate a circa 2160 bp (tra 2176 e 2152 bp) e 2120 bp (tra 2131 e 2114 bp) hanno dimostrato di interagire con le proteine leganti il DNA mediante esperimenti di impronta e saggi di gel-shift (Hasegawa et al., 1996). Una delezione nel promotore del topo che comprende queste tre sequenze footprinted completamente ha abolito l’attività trascrizionale del promotore prossimale pro-Col1a2 negli esperimenti transitori di trasfezione facendo uso delle linee cellulari fibroblastiche. Le regioni corrispondenti nel promotore umano pro-COL1A2 sono state protette anche in esperimenti di footprinting in vivo e in vitro (Ihn et al., 1996) e attivatori trascrizionali rilegati. Tuttavia, i test di gel-shift eseguiti utilizzando il promotore umano pro-COL1A2 hanno suggerito che un elemento ad azione cis situato a 2160 bp rappresenta un elemento repressore (Ihn et al., 1996), implicando che le interazioni tra proteine che interagiscono con gli elementi attivatori a 2300, 2125 e 280 bp e le proteine che si legano a un elemento repressore a 2160 bp regolano questo gene. Più recentemente è stato dimostrato che CUX1, una proteina di spostamento CCAAT, è associata a una ridotta espressione del collagene di tipo I sia in vivo che in vitro e che migliorare l’espressione di CUX1 provoca un’efficace soppressione del collagene di tipo I interferendo con il legame CBF (Fragiadaki et al., 2011).
Sp1 e Sp3 hanno dimostrato di legare il motivo TCCTCC situato tra 2123 e 2128 bp; entrambi i fattori di trascrizione attivano questo promotore (Ihn et al., 2001) (vedi Fig. 13.2 B). Inoltre, le proteine che si legano ai due segmenti prossimali si legano anche al segmento più a monte ricco di GC, a 2300 bp, ad eccezione del CBF, suggerendo una ridondanza tra i segmenti di DNA funzionalmente attivi del promotore prossimale pro-COL1A2.
TGFß media la sua azione nel promotore umano attraverso la combinazione del fattore di trascrizione onnipresente Sp1, del complesso Smad3 / 4 e dei coattivatori p300 / CREB-binding protein (CBP) in quello che viene definito un elemento TGFß-responsive (TßRE) (Zhang et al., 2000). Questo segmento contiene tre motivi ricchi di GC tra 2330 e 2255, in grado di legare Sp1, CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP), activator protein 1 (AP1) e complessi Smad (Chen et al.,1999, 2000a, b; Kanamaru et al., 2003; Tamaki et al., 1995; Zhang et al., 2000). L’interazione tra questi fattori nucleari è sinergica e richiede il legame di Sp1 e Smad3 / 4 agli elementi ricchi di GC e al sito Smad a valle di CAGAC, rispettivamente (Ghosh et al., 2000; Poncelet e Schnaper, 2001; Zhang et al., 2000). Alla fine di questo secolo, c’è stato un grande dibattito sul fatto che gli Smad siano più importanti dell’AP1 nel promotore prossimale. Ciò è stato risolto circa 10 anni dopo, quando è stato dimostrato che TGFß attiva anche il gene COL1A2 tramite una via di segnalazione non canonica (indipendente da Smad), che richiede una cooperazione enhancer/promoter che coinvolge lo scambio di occupazione del fattore di trascrizione c-Jun/JunB di un sito critico di enhancer, con conseguente stabilizzazione della coalescenza enhancer/promoter (Ponticos et al., 2009). Un rapporto che esplora gli effetti dell’ipossia e del TGFß sul gene COL1A2 ha aggiunto al potenziale ruolo degli Smad, in particolare Smad3, nella regolazione dell’espressione del collagene. Questi studi in cellule mesangiali umane suggeriscono che in condizioni ipossiche e in presenza di TGFß, il fattore inducibile all’ipossia 1α (HIF-1α) e Smad3 possono formare complessi trascrizionali e migliorare preferenzialmente il legame con uno dei tre elementi di risposta all’ipossia all’interno del promotore umano COL1A2 in posizione -335 bp (Baumann et al., 2016). Gli autori suggeriscono che questa nuova interazione fornisce un meccanismo che spiega la sinergia osservata tra HIF e TGFß nella fibrosi renale.
TNFa e interferone-γ (IFN-γ) sopprimono la produzione della matrice. In contrasto con il singolo elemento di DNA che media la stimolazione TGFß del promotore prossimale COL1A2, sia TNFa che IFN-γ hanno dimostrato di inibire la trascrizione COL1A2 interferendo con la formazione del complesso indotto da TGFß e stimolando l’interazione di fattori negativi con elementi di DNA reattivi situati a 5′ e 3′ di esso. Questo cosiddetto “elemento reattivo alle citochine” svolge un ruolo importante nel mantenimento dell’omeostasi. Il coinvolgimento di AP1 e NF-kB nella trasduzione dell’azione inibitoria del TNFa sull’espressione genica COL1A2 è stato dimostrato utilizzando fibroblasti immortalati da topi privi dell’attivatore AP1 Jun N-terminal chinasi 1 (JNK1) o del modulatore essenziale NEMO NF-kB. Nello specifico, la perdita di JNK1 ha impedito l’antagonismo TNFa di TGFß, ma ha preservato l’inibizione TNFa dell’espressione COL1A2 costitutiva. L’antagonismo di TGFß da parte di TNFa comporta la fosforilazione di JNK1 di c-jun, portando alla competizione off-DNA di quest’ultima molecola per il legame Smad3 al sito del DNA affine e/o per l’interazione con i coattivatori p300 / CBP (Kouba et al., 1999; Verrecchia et al., 2001, 2002).
Il legame di IFN-γ ai suoi recettori porta alla fosforilazione della tirosina della chinasi di janus (JAK) tirosin chinasi e questo a sua volta si traduce in trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione (STAT1) fosforilazione. In COL1A2, l’attivazione STAT1 si traduce in competizione con Smad3 per l’interazione con p300 / CBP (Inagaki et al., 2003). Inoltre, JAK1 può anche attivare il fattore di trascrizione Y-box binding factor (YB-1); questa attivazione provoca sia l’inibizione dell’attività del promotore costitutivo attraverso il legame YB-1 della scatola 2125TC che l’antagonismo dei segnali TGFß attraverso la competizione YB-1 con Smad3 e/o p300/CBP (Ghosh et al., 2001; Higashi et al., 2003). Per maggiori dettagli, vedere “Fattori di crescita” e ” Citochine.”
Est1 / Fli1 hanno anche dimostrato di legare la stessa sequenza con effetti opposti sulla trascrizione del collagene di tipo I. Un fattore di trascrizione Ets funzionale è stato identificato in COL1A2 in prossimità dei siti Sp1. Ets1 stimolato, mentre Fli1 inibito, attività del promotore. Il legame Sp1 era essenziale per l ‘ inibizione di Fli1. Inoltre, la sovraespressione di Fli1 nei fibroblasti dermici ha portato a una diminuzione dei livelli di mRNA e proteine COL1A2 (Czuwara-Ladykowska et al., 2001). Inoltre, il trattamento TGFß dei fibroblasti dermici porta alla dissociazione di Ets1 dai complessi CBP / p300 e altera la loro risposta a TGFß a favore della degradazione della matrice (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).
Inoltre, un motivo CpG a 17 bp ha dimostrato di essere preferenzialmente metilato e legato da proteine RFX in cellule che acquisiscono uno stato collagene I–negativo. Esperimenti di trasfezione cellulare in combinazione con test di legame al DNA hanno assegnato proprietà positive o negative a ciascuna delle proteine che si legano al promotore prossimale di pro-COL1A2 (Sengupta et al., 2002). Il grado di metilazione nel sito 17 CpG, d’altra parte, ha dimostrato di modulare l’affinità di legame delle proteine RFX e, di conseguenza, la loro capacità di ridurre l’attività del promotore reclutando proteine associate che interferiscono con l’assemblaggio di complessi trascrizionali ad azione positiva (Xu et al., 2003, 2004).