c Metilare Agenti
croce-sensibilità di alcuni ceppi di batteri all’esposizione ai raggi UV e la monofunzionali agente alchilante MMS, in contrasto con i composti discusso finora, non sembra essere dovuto ad un simile riconoscimento di soggetti ad accisa danni dalla stessa endonucleasi che riconosce i dimeri di timina nel DNA. L’esistenza di mutanti batterici sensibili all’MMS è una prova prima facie dell’esistenza di meccanismi di riparazione nel tipo selvaggio, ma ora sembra che non sia una base alchilata di per sé riconosciuta da un meccanismo di riparazione, ma probabilmente una rottura a singolo filamento nel DNA. Dopo il trattamento con MMS, B. subtilis è stato inattivato dalla formazione di rotture a singolo filamento nel DNA, che, è stato dimostrato, il wild-type B. subtilis può riparare (Strauss e Wahl, 1964; Prakash e Strauss, 1970); tuttavia, un mutante sensibile all’MMS era carente o privo di questa capacità. Inoltre, è stato sostenuto che la sensibilità crociata osservata ai raggi UV o ai raggi X potrebbe essere spiegata dalla formazione di rotture a singolo filamento che sono note per essere formate da questi ultimi agenti.
La conferma di questo punto di vista è stata ottenuta dalle proprietà di un mutante B. subtilis che era sensibile all’irradiazione UV ma non all’MMS (Searashi e Strauss, 1965). Quella metilazione delle basi del DNA, piuttosto che le rotture del filo indotte da MMS, non evoca alcuna riparazione di escissione in B. subtilis è stato anche chiaramente dimostrato dall’incapacità di osservare qualsiasi perdita significativa di gruppi metilici dal DNA di cellule wild-type o sensibili durante diverse generazioni di cellule. Questa scoperta ha indicato la capacità delle cellule di replicare il DNA metilato ed è coerente con la capacità replicativa del DNA modificato dall’arilalchilazione (Venitt e Tarmy, 1972).
Lo studio di cui sopra sulla riparazione del danno da metilazione indotto da MMS in B. subtilis può, quindi, essere contrastato con altri studi sulla riparazione del danno di alchilazione introdotto dall’agente metilante monofunzionale MNNG (Lawley e Orr, 1970) in E. coli B/r. Differisce dall’MMS nel produrre una proporzione sensibilmente più alta di residui di O 6-metilguanina nel DNA alchilato. Questo prodotto così come la 3-metiladenina e forse alcuni prodotti non identificati (materiale di origine su cromatogrammi di carta) sembrano essere asportati selettivamente rispetto alla perdita di N −7-metilguanina dal DNA delle cellule di E. coli B/r in condizioni che consentono sia la crescita che la sintesi del DNA. Anche la 3-metiladenina e la O 6-metilguanina, ma non il materiale di origine, sono state asportate dalle cellule Bs–1 ma possibilmente a un tasso ridotto. Non è stato dichiarato da Lawley e Orr se vi fosse o meno alcuna differenza nella sopravvivenza delle cellule B/r e Bs-1 trattate con MNNG, il che potrebbe indicare che tali differenze nella capacità di escissione riflettono il funzionamento di un meccanismo di riparazione del DNA che aiuta la sopravvivenza delle cellule. Tuttavia, Kondo et al. (1970) non ha riportato un aumento della mortalità o una maggiore frequenza di mutazione in E. coli, per ceppi incapaci di asportare i dimeri di pirimidina, dopo il trattamento con MNNG, rispetto all’MMS. Ciò nonostante il fatto che l’alchilazione del DNA da parte di MNNG produca 20 volte la quantità di O 6-metilguanina rispetto a quella prodotta dall’alchilazione del DNA da parte di MMS (Lawley et al., 1971–1972).
La prova che questa “perdita” di 3-metiladenina e O 6-metilguanina è mediata da un meccanismo di escissione enzimatica, diverso da un’endonucleasi UV, è venuta da studi in vitro sulle proprietà di un enzima, designato endonucleasi II, isolato da E. coli (Friedberg e Goldthwait, 1969). Questo enzima è in grado di rompere i legami fosfodiesterici nel DNA che è stato fatto reagire con l’agente alchilante MMS e di riconoscere i siti depurati nel DNA. Più recentemente, è stato dimostrato di rilasciare O 6-metilguanina e N 3-metiladenina ma non N 7-metilguanina dal DNA che era stato metilato dal cancerogeno MNU (Kirtikar e Goldthwait, 1974). L’endonucleasi II, quindi, possiede chiaramente molte funzioni diverse, una delle quali sembra in grado di recidere i legami glicosidici legati a determinate purine sostituite. D’altra parte, potrebbe essere una miscela di enzimi. L’esistenza di un enzima che è similmente in grado di eseguire questa scissione postulata di legami N-glicosidici (e quindi chiamata N-glicosidasi) è stata recentemente isolata da E. coli e ha dimostrato di rilasciare uracile libero da residui di citosina deaminati contenenti DNA (Lindahl, 1974). Il sito depurinato risultante può quindi essere riconosciuto e riparato da un altro sistema enzimatico associato (cfr. Verly e Paquette, 1972). La specificità di una preparazione di E. coli inoltre è stata osservata per 3-alchiladenina ma non per 7-alchiladenina da Papirmeister et al. (1970). 3-Etiladenina e O 6 −etilguanina ma non residui di N-7-etilguanina nel DNA formato dalla reazione di N-etil-N-nitrosourea sono stati trovati per essere asportati in modo simile dal DNA di E. coli WP2 (Lawley e Warren, 1975). L’escissione dei prodotti minori dell’alchilazione delle purine è stata ora osservata nelle cellule di mammifero in vivo e, inoltre,la ridotta capacità di escissione in alcuni tessuti è stata correlata con l’identità dell’organo bersaglio per alcuni agenti cancerogeni alchilanti (vedere più avanti Sezione I, C della parte B).
L’apparente mancanza di riconoscimento ed escissione di residui di N 7-alchilguanina nel DNA mediante un meccanismo di riparazione, come indicato dagli studi di Prakash e Strauss (1970) e di Lawley e Orr (1970), era evidente anche negli studi di Kimball et al. (1971a) sugli effetti di MMS e MNNG in Haemophilus influenzae. È, quindi, un po ‘ sorprendente che questo stesso residuo sembra essere riconosciuto in Euglena gracilis. Dopo la metilazione con N-metil-N-nitroso-p-toluensulfonato, la 7-metilguanina è stata persa dal DNA con un’emivita di 10 ore (Olson e McCalla, 1969) che è sensibilmente più breve dell’emivita di circa 5 giorni per l’idrolisi spontanea a pH 7,4 nel tampone acido-fosfato citrico (Margison et al., 1973). Inoltre, un ceppo mutante resistente apparentemente asportava la N-7-metilguanina più rapidamente del ceppo sensibile con la comparsa di mononucleotidi dal DNA degradato nel surnatante cellulare (Olson e McCalla, 1969). Questa scoperta inaspettata, quindi, merita ulteriori indagini. Questi risultati, quindi, insieme alla leggera indicazione di una perdita più rapida di 7-metilguanina dal DNA del fegato di ratto in vivo notato da Margison et al. (1973), ma non da Craddock (1973a), potrebbe suggerire che questo sostituente del DNA può essere riconosciuto da un enzima di riparazione in determinate circostanze.
La tabella VI riassume i precedenti esempi di perdita di prodotti chimici dal DNA batterico.