Due-dimensionale elettroforesi del gel di poliacrilammide (2D-PAGE): progressi e prospettive

Introduzione

ultimi 25 anni, e in particolare l’ultimo decennio, si è assistito a un maggiore sforzo per sviluppare tecnologie in grado di identificare e quantificare un gran numero di proteine espresse all’interno di una cella di sistema (cioè, il proteoma), nella speranza di individuare biomarcatori delle malattie, la mappatura di proteine circuiti, o identificazione di nuovi siti di fosforilazione, per esempio. La complessità del proteoma ha reso lo sviluppo di metodi per la separazione efficiente e la rilevazione sensibile delle proteine una componente critica di questo sforzo. I continui progressi nella tecnologia della spettrometria di massa (MS) hanno permesso il rilevamento di proteine con velocità e sensibilità molto maggiori di quanto possibile in precedenza. Anche la SM all’avanguardia, tuttavia, non è in grado di caratterizzare tutti i componenti all’interno di un proteoma complesso. Gli scienziati adottano un approccio “divide et impera” per caratterizzare i proteomi, in quanto tentano di limitare temporalmente il numero di proteine che lo spettrometro di massa è chiamato ad analizzare. Diffondendo il proteoma, più proteine saranno infine analizzate all’interno di un singolo esperimento.

Per separare i proteomi, gli scienziati hanno utilizzato tecnologie elettroforetiche e cromatografiche, separatamente e in combinazione, sia offline che online. Sebbene questi sforzi possano portare alla separazione e all’identificazione di migliaia di proteine, nessun singolo metodo può risolvere tutte le proteine in un proteoma, a causa del loro grande numero e della gamma dinamica di concentrazione. Le separazioni a dimensione singola sono inadeguate per risolvere efficacemente miscele proteiche complesse. Questo fatto è stato riconosciuto oltre mezzo secolo fa da Smithies e Poulik (1), che hanno riconosciuto che una combinazione di due processi elettroforetici su un gel ad angolo retto dovrebbe dare un grado di risoluzione molto maggiore di quanto sia possibile con entrambi separatamente. I due processi elettroforetici sono la risoluzione per dimensione molecolare e la mobilità della soluzione libera su un gel di amido. La loro previsione continua ad essere dimostrata vera e ha costituito la base per lo sviluppo di metodologie multidimensionali ortogonali per la separazione di miscele complesse non solo mediante elettroforesi su gel ma anche mediante cromatografia ed elettroforesi capillare.

Per comprendere correttamente i progressi fatti nella PAGINA bidimensionale (PAGINA 2D), è necessario tornare indietro di molto più di un quarto di secolo. Nel 1930 Tiselius introdusse il metodo del limite mobile come strumento analitico per lo studio dell’elettroforesi delle proteine (2). Dal suo lavoro pionieristico, varie forme di elettroforesi sono state utilizzate per la separazione di miscele complesse di proteine, ognuna con una risoluzione migliorata. Già nel 1962, Raymond e Aurell (3) dimostrarono i significativi effetti non lineari della concentrazione di gel sulla mobilità elettroforetica delle proteine impiegando l’elettroforesi 2-D utilizzando diverse concentrazioni di gel di acrilammide per separare le proteine del siero. Due anni dopo, Raymond (4) ha dimostrato la superiorità dei gel a lastra piatta rispetto ai gel a tubo cilindrico. Per esempio, lastra piatta fornisce la massima superficie per il raffreddamento del gel; i modelli risultanti sono più facili da quantificare in standard di registrazione densitometri; un gran numero di campioni che possono essere trattati con una singola lastra di gel, facilitando il confronto diretto dei campioni trattati in condizioni identiche; e, cosa più importante, lastra piatta, permette l’applicazione di 2-D separazioni. Queste preferenze penetranti si sono dimostrate vere e sono praticate oggi in molti laboratori bioanalitici.

Un altro avanzamento nelle separazioni in gel 2-D fu introdotto nel 1972 da Wright (5), che utilizzò una colonna di gel di poliacrilammide del 4,75% (2% cross-linkage) nella prima dimensione, che fu poi rimossa dal cilindro di vetro e posata sul bordo superiore di una lastra con gradiente del 2%. Dopo l’elettroforesi, la lastra di gel è stata posta in una soluzione di colorazione, con conseguente visualizzazione di 112 proteine del siero umano risolte.

Questi nuovi approcci hanno risolto solo un piccolo numero di proteine, principalmente le proteine più abbondanti di una cellula o proteoma sierico. L’introduzione della 2D-PAGE nel 1975 da parte di O’Farrell (6) per separare le proteine cellulari in condizioni di denaturazione ha permesso la risoluzione di centinaia di proteine. Il principio applicato era molto semplice: le proteine sono state risolte su un gel utilizzando la messa a fuoco isoelettrica (IEF), che separa le proteine nella prima dimensione in base al loro punto isoelettrico, seguita dall’elettroforesi in una seconda dimensione in presenza di sodio dodecil solfato (SDS), che separa le proteine in base alla loro massa molecolare. Il metodo di O’Farrell è veramente la base della moderna PAGINA 2D, che è stata rapidamente adattata e ampiamente accettata da altri ricercatori. Anderson e Anderson (7) hanno usato 2D-PAGE per l’analisi delle proteine plasmatiche umane. Sono stati in grado di separare e rilevare circa 300 macchie proteiche distinte dopo la colorazione. A differenza di O’Farrell, Manabe (8) ha separato le proteine plasmatiche umane usando 2D-PAGE senza agenti denaturanti. Circa 230 macchie proteiche potrebbero essere osservate sul gel; tuttavia, le macchie sono state macchiate e non ben risolte.

Introduzione di gradienti di pH immobilizzati

Come menzionato sopra, 2D-PAGE comprende IEF nella prima dimensione, seguita da SDS-PAGE nella seconda dimensione. Dalla sua introduzione da parte di Kolin nel 1954 (9), IEF ha subito diversi progressi. La prima dimensione viene effettuata in barre di gel di poliacrilammide che si formano in tubi di vetro o di plastica e contengono anfoliti che formano un gradiente di pH in un campo elettrico. Queste aste erano storicamente irriproducibili, instabili e difficili da lavorare. L’introduzione dei gradienti di pH immobilizzati (IPGs) di Bjellqvist et al. (10) ha avuto un impatto significativo sull’uso dell’IEF per separare miscele complesse in un ampio intervallo di pH. L’IPGs ha permesso la formazione di gradienti di pH stabili e riproducibili in grado di focalizzare proteine acide e basiche su un singolo gel preparato con ampi gradienti di pH. In IPGs, gli anfoliti carrier sono attaccati alle molecole di acrilammide e gettati nei gel per formare un gradiente di pH fisso. Il fissaggio del gradiente impedisce la deriva nel gel e garantisce anche che possano essere fusi in modo efficiente e riproducibile. L’utilizzo di strisce IPG a gamma ristretta ha permesso di separare un numero maggiore di proteine rispetto a quanto era stato possibile con la pagina 2D standard perché un intervallo di pH più ristretto era distribuito su una distanza fisica maggiore. Questa diffusione ha permesso alle proteine con i simili valori isoelettrici del punto (pI) di essere separate con più alta risoluzione. Per illustrare questo punto, Hoving et al. sviluppato un metodo 2D-PAGE in cui hanno applicato strisce IPG a gamma stretta nella prima dimensione (11). Le strisce IPG erano tipicamente larghe 1-3 pH U e si sovrapponevano l’una all’altra di almeno 0,5 pH U. Sono state utilizzate sei strisce IPG che coprivano l’intervallo di pH da 3,5 a 10. Proteine da una linea cellulare B-linfoma sono stati applicati a ciascuna striscia e separati utilizzando IEF. Ogni striscia è stata quindi applicata a una singola lastra di gel SDS-PAGE e le proteine sono state separate nella seconda dimensione in base al loro peso molecolare. Circa 5000 punti distinti sono stati rilevati utilizzando le sei strisce IPG, rispetto a 1500 punti rilevati utilizzando una singola striscia IPG con un intervallo di pH di 3-10 e una singola piastra gel standard 2D-PAGE. Wildgruber et al. (12) ha confrontato l’uso di 3 strisce IPG con intervalli di pH di 4-5, 5-6 e 5,5–6,7 contro gel eseguiti con strisce IPG con intervalli di gradiente di pH di 3-10 e 4-7. Sono stati in grado di rilevare 2,3 e 1,6× più macchie proteiche utilizzando tre strisce IPG a intervallo stretto rispetto alle due strisce IPG a gradiente più ampio (3-10 e 4-7), rispettivamente.

Mentre la risoluzione più elevata ottenibile utilizzando più IPG stretti sovrapposti consente l’identificazione di più proteine, ogni striscia stretta richiede una piastra di gel separata e una certa quantità dello stesso campione da caricare su ciascuna. Questo requisito significa che se il volume o la concentrazione del campione sono limitati, un tale esperimento potrebbe non essere possibile. Per campioni limitati, è necessario considerare un intervallo di pH più ampio o un numero minimo di IPGs.

Elettroforesi differenziale bidimensionale In gel (2D-DIGE)

L’obiettivo di separare le proteine utilizzando la pagina 2D è duplice: (i) identificare nuove proteine e (ii) misurare la loro abbondanza relativa tra campioni comparativi. Un vantaggio di 2D-PAGE come tecnica di separazione è che non solo risolve un gran numero di proteine, ma la colorazione di queste proteine consente di quantificare le abbondanze relative delle proteine. Ad esempio, le proteine estratte da due campioni di siero (sani e malati) vengono caricate ciascuna su una piastra di gel separata. Dopo la colorazione, le macchie proteiche vengono allineate e scansionate per misurare le loro intensità individuali. Mentre sono stati fatti molti progressi negli strumenti di allineamento del software, è stato difficile garantire un confronto diretto spot-to-spot tra due gel separati. Lo sviluppo dell’elettroforesi differenziale in gel 2D (DIGE) nel 1997 ha superato questa limitazione consentendo di separare fino a tre distinte miscele proteiche all’interno di un singolo gel a 2D (13). In un tipico esperimento 2D-DIGE, le proteine estratte da tre diversi campioni, sani, malati e controllo interno (un campione aggregato formato dalla miscelazione di quantità uguali di proteine estratte dai campioni sani e malati), sono etichettate in modo covalente, ciascuna con un colorante fluorescente alla cianina che ha una diversa lunghezza d’onda di eccitazione ed emissione. I campioni sono migrazione abbinato, in modo che la stessa proteina etichettata con uno qualsiasi dei coloranti migrerà nella stessa posizione sul gel. I coloranti cianinici che sono stati utilizzati sono: 1-(5-carbossi-pentil)-1′-propilindocarbacianina alogenuro N-idrossisuccinimidil estere(Cy3); 1-(5-carbossipentil)-1′-metilindodicar-bacianina alogenuro N-idrossisuccinimidil estere(Cy5); e 3-(4-carbossimetil)fenilmetil-3′ – etilossacarbacianina alogenuro N-idrossisuccinimidil estere (cy2). Concentrazioni uguali delle proteine diversamente etichettate e del campione di controllo vengono miscelate, applicate a una singola piastra di gel e separate utilizzando la PAGINA 2D. Il campione di controllo funge da standard interno, consentendo la corrispondenza tra e intra-gel. Il campione di controllo deve contenere tutte le proteine presenti in tutti i campioni in un esperimento. Ciò significa che ogni proteina nell’esperimento ha un segnale unico nello standard interno, che viene utilizzato per confronti quantitativi diretti all’interno di ciascun gel e per normalizzare i valori di abbondanza quantitativa per ogni proteina tra i gel. La scansione del gel alle specifiche lunghezze d’onda di eccitazione di ciascun colorante, utilizzando un imager a fluorescenza, consente la visualizzazione delle proteine etichettate in modo differenziato (Figura 1). Le immagini vengono quindi unite e analizzate utilizzando un software di imaging, che consente di confrontare le differenze tra i livelli di abbondanza di proteine. Il valore in DIGE elimina qualsiasi errore relativo al disallineamento del gel e garantisce una quantificazione accurata (14).

Le proteine di interesse vengono asportate dal gel, digerite proteoliticamente e identificate utilizzando la SM. Poiché viene eseguita utilizzando una singola piastra di gel, 2D-DIGE richiede il 50% in meno di gel, rendendolo più economico e le differenze nell’espressione proteica tra due diversi campioni di proteine sono più facili da confrontare e più accuratamente imaged. Inoltre, è necessario meno tempo per rilevare le macchie proteiche perché la reazione di etichettatura in DIGE è più veloce della visualizzazione utilizzando metodi di colorazione. Quando è necessario confrontare i livelli di espressione proteica di due campioni diversi, DIGE è il metodo di scelta (15).

Punti di forza e di debolezza di 2D-PAGE

L’elettroforesi è una tecnica consolidata che ha subito diversi progressi che hanno migliorato la risoluzione, il rilevamento, la quantificazione e la riproducibilità. Gli approcci 2-D SDS-PAGE e 2D-DIGE al profilo proteico sono metodi accessibili ed economici che possiedono un elevato potere risolutivo e consentono la rilevazione di centinaia di proteine su una singola piastra di gel. Sebbene la riproducibilità sia stata un problema con 2D-PAGE, specialmente quando si profilano due miscele proteiche, è stata notevolmente migliorata con l’uso di 2D-DIGE. La risoluzione è stata migliorata con l’introduzione di IPGs, che consentono all’analista di personalizzare il gradiente di pH per la massima risoluzione utilizzando gel ultrazoom con un intervallo di gradiente di pH ristretto. Con la moderna PAGINA 2D, non è insolito risolvere due proteine che differiscono in pI di 0,001 U.

Sebbene la PAGINA 2D sia stata limitata dalla sua incapacità di risolvere proteine troppo basiche o troppo acide, troppo grandi o troppo piccole, questa limitazione diminuisce continuamente. Ad esempio, la separazione delle proteine di base può essere analizzata utilizzando IPGs nell’intervallo di pH di 4-12. La scienza della separazione è in continua evoluzione e non passerà molto tempo prima che i restanti problemi dell’elettroforesi su gel siano adeguatamente risolti.

L’introduzione di 2D-DIGE ha contribuito immensamente a risolvere i problemi di riproducibilità e quantificazione. L’uso di imager e computer consente non solo il data mining veloce, l’acquisizione e l’analisi, ma anche il rilevamento spot, la normalizzazione, la profilazione delle proteine, la correzione dello sfondo e la segnalazione e l’esportazione dei dati. Come tecnica di separazione, rilevazione e quantificazione, 2D-DIGE è uno strumento importante, specialmente per i laboratori clinici coinvolti nella determinazione dei livelli di espressione proteica e nella scoperta di biomarcatori di malattie. Quando la variazione biologica assoluta tra i campioni è l’obiettivo principale, come nella scoperta di biomarcatori, 2D-DIGE è il metodo di scelta.

Mentre ci sono stati progressi significativi nei metodi nongel (o basati su soluzioni) per accoppiare i metodi di frazionamento direttamente online con l’analisi MS, 2D-PAGE è rimasta una tecnica popolare per condurre studi proteomici. Sebbene la PAGINA 2D, come qualsiasi schema di frazionamento, abbia i suoi vantaggi e svantaggi, non c’è dubbio che rimarrà una tecnica essenziale per la caratterizzazione dei proteomi per molti anni a venire.