2.1.1 modelli transgenici c-Myc
Il protooncogene c-myc codifica una fosfoproteina nucleare multifunzionale a 62 kDa e si trova sul cromosoma 8q24.21 negli esseri umani. c-Myc funziona come un fattore di trascrizione che attiva l’espressione di un numero di geni necessari per la progressione del ciclo cellulare da G1 a S fase. Paradossalmente, l’espressione di c-Myc può anche promuovere fortemente la morte cellulare apoptotica. l’espressione di c-Myc aumenta durante la proliferazione correlata alla gravidanza nella ghiandola mammaria normale. Tuttavia, è assente nelle cellule alveolari differenziate durante l’allattamento, ma aumenta di nuovo durante il normale processo di involuzione mammaria apoptotica (Liao & Dickson, 2000). Nei tumori umani, la deregolamentazione dell’espressione di c-myc può verificarsi attraverso meccanismi multipli. Il gene c-myc è amplificato in circa il 16% e riorganizzato in circa il 5% dei tumori al seno umani, mentre la proteina c-Myc è sovraespressa nel 45-70% dei tumori al seno umani (Blackshear, 2001; Deming, Nass, Dickson, & Trock, 2000; Spandidos, Field, Agnantis, Evan, & Moore, 1989). L’amplificazione di c-myc correla con la prognosi povera del paziente (Deming et al., 2000).
L’attivazione di c-myc è stata implicata come un passo critico nello sviluppo del carcinoma mammario sia negli esseri umani che nei topi. Il laboratorio Leder ha sviluppato topi transgenici MMTV-c-myc che esprimono c-myc specificamente nelle ghiandole mammarie ad alti livelli nei topi femminili e nelle ghiandole salivari di maschi e femmine a livelli inferiori (Stewart et al., 1984). Questi topi sviluppano adenocarcinomi mammari in animali multipari con un’incidenza del 100%. Data la reattività ormonale del promotore MMTV, non sorprende che l’incidenza e la latenza del tumore dipendano dal numero di gravidanze. Nelle femmine multipare, gli adenocarcinomi normalmente si sviluppano a 5-6 mesi di età e corrispondono alla seconda o terza gravidanza. I tumori metastatici sono rari, ma sono stati osservati nel polmone. Non si osservano tumori nei topi maschi (Stewart et al., 1984).
Topi transgenici che esprimono c-myc sotto il controllo del promotore murino WAP sono stati generati anche da due gruppi indipendenti (Sandgren et al., 1995; Schoenenberger et al., 1988). La frequenza dei tumori nei topi WAP-c-myc era molto più alta di quella della loro controparte guidata da MMTV. I topi femminili WAP-c-myc iniziano a sviluppare tumori mammari entro 2 mesi dall’inizio dell’espressione del transgene (gravidanza). Circa l ‘ 80% delle femmine sviluppa tumori palpabili dopo aver subito due cicli di gravidanza, e i singoli topi spesso sviluppano tumori multipli che colpiscono una singola o più ghiandole (Schoenenberger et al., 1988). I topi vergini non sviluppano tumori (monitorati fino a 14 mesi). I topi WAP-c-myc formano tumori mammari ben differenziati e acquisiscono espressione costitutiva e secrezione di β-caseina e myc transgenico.
Mentre questi studi convalidano il potenziale di c-myc di guidare la tumorigenesi mammaria, ulteriori osservazioni hanno rivelato la necessità di ulteriori eventi genetici nello sviluppo del carcinoma mammario derivato da MMTV-c-myc e WAP-c-myc. Ad esempio, i tumori sono sorti focalmente, anche se l’espressione di c-Myc è stata osservata in tutto il normale epitelio mammario di topi femmina MMTV-c-myc e WAP-c-myc durante l’ultima parte della gravidanza e durante l’allattamento. Inoltre, sebbene l’integrazione cromosomica casuale di c-myc nei topi MMTV-c-myc abbia causato l’espressione del transgene in più tessuti, c-myc ha suscitato solo neoplasie nel tessuto mammario. Inoltre, la lunga latenza dei tumori e la dipendenza dalla gravidanza suggerisce che c-myc stesso potrebbe non essere sufficiente per l’induzione di tumori mammari.
L’osservazione che c-myc da solo era insufficiente a guidare la tumorigenesi in tutte le ghiandole mammarie ha istruito studi di follow-up utilizzando modelli murini doppi transgenici (o bitransgenici). Topi transgenici doppi che trasportano sia il c-myc che un altro gene, come v-Ha-ras (Sinn et al., 1987), TGF-α (fattore di crescita trasformante α) (Amundadottir, Johnson, Merlino, Smith, & Dickson, 1995), bcl-2 o neu, sviluppano tumori mammari a frequenze più alte e con latenza più breve. MMTV-c-myc/MMTV-v-Ha-ras e MMTV-c-myc/MT-TGFa doppi topi transgenici hanno aiutato a chiarire che c-myc potrebbe sinergizzare con v-Ha-ras e TGFa per ridurre la latenza del tumore ed eliminare il requisito per la gravidanza per l’iniziazione del tumore. In particolare, i topi MMTV-c-myc/MT-TGFa doppi transgenici non sviluppano tessuto mammario normale e il tessuto mammario da topi di 3 settimane può formare tumori quando trapiantati in topi atimici. Ciò indica che c-myc e TGFa possono sinergizzare nel trasformare l’epitelio mammario, richiedendo poche o nessuna alterazione genetica aggiuntiva (Amundadottir et al., 1995; Amundadottir, Nass, Berchem, Johnson, & Dickson, 1996).
Il laboratorio di Chodosh ha sviluppato un modello murino transgenico che ha permesso il controllo temporale dell’espressione specifica mammaria di c-myc dopo il trattamento con derivati della tetraciclina (Boxer, Jang, Sintasath, & Chodosh, 2004). In questo modello, il promotore di MMTV spinge l’espressione dell’attivatore trascrizionale tetraciclina-dipendente inverso, rtTA, e in presenza di doxiciclina, induce l’espressione di c-myc fuso ad un promotore tetraciclina-dipendente (topi transgenici MMTV-rtTA/TetO-MYC). L’induzione cronica di c-myc in questi topi transgenici provoca adenocarcinomi mammari solitari dopo circa 22 settimane. Questo modello è di importanza in quanto consente la valutazione della dipendenza tumorale su continua espressione c-myc una volta che il tumore si è formato, o “dipendenza oncogene.”Una volta che i tumori mammari sono stati osservati, i topi sono stati tolti doxiciclina per valutare se i tumori sarebbero regredire. È interessante notare che solo circa la metà dei tumori è regredita dopo l’inibizione dell’espressione di c-myc mediante rimozione della doxiciclina. Pertanto, l’inattivazione di c-myc non ha portato a un’inversione dei tumori e i tumori sono stati in grado di crescere in assenza di sovraespressione di c-myc. Tra i tumori che non sono riusciti a regredire dopo l’inattivazione di c-myc, quasi tutti i tumori hanno ripreso la crescita anche in assenza di espressione di c-myc. Ciò suggerisce che la maggior parte dei tumori mammari primari derivanti dall’attivazione di c-myc ha già acquisito la capacità di crescere in assenza di sovraespressione di c-myc. Tra i tumori che erano regrediti in assenza di c-myc, la maggior parte dei tumori si è ripresentata spontaneamente nel sito iniziale entro 1 anno dopo il ritiro della doxiciclina. I tumori mammari sono stati trovati a ripresentarsi a causa della presenza di cellule neoplastiche residue che persistevano nelle ghiandole mammarie di quasi tutti gli animali con tumori completamente regrediti. La riattivazione di c-myc nelle cellule neoplastiche residue ha determinato una rapida ricrescita dei tumori. Inoltre, cicli successivi di espressione di c-myc hanno portato alla progressione di quasi tutti i tumori a uno stato indipendente dalla doxiciclina.