インスリンシグナル伝達経路のルールベースのモデル

インスリンシグナル伝達経路のモデル

3つの公開されたモデルから始めて、図1に示すようにISPのモデルを実装しました。 1システムバイオロジーのグラフィカル表記を使用します。

インスリンシグナル伝達経路のモデル。 ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路、ｍＴＯＲ経路およびＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路を統合することによって得られたインシュリンシグナル伝達経路のモデルは、システム生物学のグラフィカル表記を使用して描写される。 色付きのノードは、シミュレートされたプロファイルで得られたクラスタリング結果に似ています(図を参照)。 3 ). 色付きの線は、重要なフィードバックメカニズムを表します。: 赤い線はP70S6K-IRS1負帰還ループ、青い線はERK1/2-GRB2/SOS負帰還ループを表します

このモデルは、以下で簡単に説明するＩＳＰの３つの主要なサブ経路が含まれているので、インスリン作用に関与する必須要素の多くを含む。

PI3K-AKT経路

PI3K-Akt経路については、主にSedaghat et al. . モデルは複数の研究グループによって使用され、ブドウ糖の運送者GLUT4の転座を仲介する最も知られていた信号を送る部品の多数を含んでいます。 これらは、インスリン受容体結合とリサイクルサブシステムが含まれています;インスリン受容体substrate1(IRS1)でSerとTyrの両方のリン酸化を含むポストレセプ; プロテインキナーゼB(AKT)およびプロテインキナーゼC(PKC)-γのリン酸化;glut4の原形質膜への転座。 タンパク質チロシンホスファターゼ（PTP1B）と脂質ホスファターゼ（SHIP2とPTEN）効果もモデルで考慮されています。

TSC1/2-mTOR経路

TSC1/2-mTOR経路については、最近Sonntag et al. 、インスリンおよびアミノ酸に応答したｍｔｏｒ効果を説明する。 このモデルでは、mtor複合体mtorc1とmtorc2の両方が考慮されます。 mtorc1活性化は、アミノ酸の存在に依存しており、順番に、5’AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）活性化に依存し、結節性硬化症タンパク質1および2（TSC1/2）活性化（ AMPKの活性化はIRS1Tyrのリン酸化に依存し、TSC1/2阻害（すなわちTyrのリン酸化）はThr309でAKTのリン酸化に依存する。 mtorc2は、最近、未知のホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ2（PDK2）として同定された、すなわち AKTのSer474リン酸化を担当するキナーゼは、ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ1（PDK1）によって操作Thr309リン酸化と一緒にAKTの二重リン酸化に貢献している。 Sonntag et al. 活性化されたインスリン受容体によって直接調節され、次にmtorc2を活性化するPI3K変異体の存在の仮説を定式化する。 この仮説をモデルに含めました。

RAS-MAPK経路

RAS-MAPK経路については、主にBorisovらのモデルを参照してください。 、EGFとインスリン刺激の両方を記述する。 モデルは、Ras-MAPK経路に関与するすべての主要な化学的メカニズムが含まれています：Tyrリン酸化IRS1とSHP2（SH2ドメイン含有チロシンプロテインキナーゼ2）とGRB2-SOS複合体（成長因子受容体結合2とsevenless複合体の息子）の相互作用、したがってSHP2-IRS1とGRB2/SOS-IRS1複合体をそれぞれ形成する。RASのGTP結合;RAFプロト癌遺伝子セリン/トレオニン-プロテインキナーゼのリン酸化（c-raf）; インスリン受容体とras gtpアーゼ活性化タンパク質（RASGAP）との相互作用は、ras失活の逆のプロセスを触媒する;完全にc-RAFを活性化する原発癌遺伝子チロシン-プロテインキナーゼSRCの活性化;二重特異性マイトジェン活性化キナーゼ1/2（MEK1/2）;細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK1/2）。

PI3K-AKT、TSC1/2-mTORおよびRAS-MAPK経路の統合

PI3K-AKT、TSC1/2-mTORおよびRAS-MAPK経路には、いくつかの重複する部分が含まれており、元の論文では、多くの場合、わずかに異なる仮定に基づいて異なる方法でモデル化されていた。 私たちは、異なるモデル間で重複する反応を比較し、細胞生化学の現在の知識に基づいて、それらの最新バージョンを実装しました。 さらに、三つのモデルの統合は、状態変数を記述するために採用された異なる測定単位を扱う必要がありました。 Immunoblot実験は、シグナル伝達イベントのタイムスケールに関する重要な情報を得ることを可能にするのに対し、タンパク質発現に関する定量的情報は、予測された濃度プロファイルが時々Borisov et alのように、マイクロモル濃度で報告されるように取得するのに問題があることが多い。 Ｓｏｎｎｔａｇ ｅ ｔ ａ ｌ．，（１ ９ ９ ９），ｓｏｎｎｔａｇ ｅ ｔ ａ ｌ．，（１ ９ ９ ９） . 対照的に、Ｓｅｄａｇｈａｔ ｅ ｔ ａ ｌ． 濃度は、モル単位または総濃度の百分率のいずれかで表された（例えば、ＧＬＵＴ４細胞質ゾル濃度は、ベースライン状態における細胞中の総ＧＬＵＴ４濃度の９ ６％であ

潜在的に、rbmは、変数の量が細胞ごとの分子のコピーで表現されることを条件として、決定論的および確率的シミュレーションの両方を実行することを可 現在の研究では確率シミュレーションを使用しなかったとしても、すべての変数を同じ単位に整列させました。 細胞当たりの分子数は、モル単位にNA*Vを掛けることによって（NAはアボガドロ数を示し、vは細胞体積を示し、3e-12lに等しいと考えられる）。 AUおよびパーセントの集中からの単位の転換についてのすべての細部は材料および方法で与えられる。

得られたモデルは、42の反応規則と101のパラメータで構成され、61の異なる化学種間の相互作用をコードします。 反応、パラメータ値、初期条件はすべて追加ファイル1に報告されています。

RBM-ISPモデルのノベルティ

RBMの実装により、複数のサイトでのシグナル伝達タンパク質のリン酸化、複数の効果、異なる結合パートナーとの分子の同時相互作用、いくつかの反応の細胞内局在など、多くのISP機能の説明が容易になった。 上記の特性は、以下で詳細に説明されています。

複数の部位におけるシグナル伝達タンパク質のリン酸化

シグナル伝達分子は、どの残基がリン酸化されているかに応じて、異なるレベルの活 たとえば、IRS1とAKTを考えてみましょう。 IRS1は、翻訳後修飾に潜在的に関与する多くの残基を有し、リン酸化された残基がTyrまたはSerであることに応じて、そのキナーゼ作用において活性化または 例えば、Ｐｉ３Ｋ、ＳＨＰ２およびＧＲＢ２結合にはＴｙｒ−８ ９ ６リン酸化が必要であるが、Ｐ７ ０Ｓ６ＫによるＳｅｒ−６ ３ ６リン酸化はインスリン抵抗性に関連する機構である。 対照的に、AKTは、それぞれPDK1およびmtorc2によるThr309またはSer474でのリン酸化によって活性化することができる。

Irs1リン酸化依存的活性化/阻害は、Sonntagモデルのように、P70s6kではなくPKCによって調節されるSerリン酸化を考慮したが、Sedeghatモデルに既に含まれていた。 ここでは、PKCとp70s6kアクションの両方をモデル化し、PI3K、SHP2とGRB2とpirs1-Tyr896複合体形成/解離を説明しました。

AKTの二つのリン酸化部位は、Sedaghat et al. . 我々は、SEDAGHATらのようにPI（3,4,5）P3によって媒介ThrでAKTリン酸化をモデル化した。 モデルおよびSerでのAKTリン酸化は、Sonntag et al. モデルと仮定:

1. I)

   AKTはThrまたは両方のサイトのいずれかでリン酸化され、Tyrでのリン酸化とSerでの脱リン酸化を仲介することによってTSC1/2複合体に作用する;

2. ii)

   C-RAFを不活性化するためのSerまたは両方の部位でのAKTリン酸化;

3. iii)

   GLUT4転座を活性化するためにThrまたはSerのいずれかでAKTリン酸化。

複数の結合パートナーとの相互作用

シグナル伝達経路内の分子と多数の異なる結合パートナーとの相互作用は、異なる複合体の潜在的な形成をもたらす。 ＩＳＰでは、Ｔｙｒ−８ ９ ６でリン酸化されたＩＲＳ１は、Ｓｅｄａｇｈａｔ ｅ ｔ ａ ｌ． またはＧＲＢ２／ＳＯＳおよびＳＨＰ２、Ｂｏｒｉｓｏｖ ｅ ｔ ａ ｌ． . ＲＢＭ-ＩＳＰモデルの仕様を現在の知識と一致させるために，異なる複合体の形成を可能にした。 したがって、ＩＲＳ１は、ＧＲＢ２／ＳＯＳおよびＳＨＰ２を相互に排他的に結合することができるが、ＧＲＢ２／ＳＯＳおよびＰＩ３Ｋのｐ８ ５調節サブユニットを同時に結合するこ

反応規則における細胞内局在に関する情報

タンパク質が相互作用しなければならない可能性は、多くの場合、それらの物理的局在、すなわち細胞外空間、細胞質、核、原形質膜などに存在することに関連している。 例えば、脂質PI（3,4,5）P3は、プレックストリン相同性（PH）ドメインを含む異なるタンパク質を募集する原形質膜ドッキングサイトとして機能する（例えば、 AKTおよびPDK1）およびそれらの共局在化は、特定の信号事象を加速することができる。 別の例は、zoncu et al.によって報告された、脳に富むRasホモログ（RHEB）およびリソソーム膜上のRagファミリーとのmTORC1の相互作用である。 . 我々のモデルでは、我々はsedaghatらによって与えられた数学的記述に従って、それらのplasmaticと細胞質の局在を区別し、インスリン受容体とGLUT4トランスポーターの細胞 .

モデル予測

モデルを移入するすべての化学種の濃度プロファイルは、60分、100nMのインスリン刺激時にシミュレートされました。 100nMの集中は文献で一般に見つけられ、私達のグループによってまた使用される細胞培養のインシュリンの刺激のよく受け入れられたレベルを表 Sonntag et al.によると。 、我々はまた、mtorc1活性化とIRS1上のp70s6kのフィードバックを得るために必要な一定のアミノ酸刺激を仮定した。 モデルの信頼性を評価するために、モデルの予測は、インスリンプラスアミノ酸、すなわちロイシン、刺激後の時間2、5、10、30および60分でいくつかのリン 図に示すように。 図2に示すように、pAKT-S473およびpmtorc1-S2448の実験および予測プロファイルは、それぞれ最初の2-5分および20-30分で定常状態に達する増加するリン酸化パター Pperk1/2-Y202、Y204の予測プロファイルは、最初の10分間の実験データによって確認されるが、最後の時点では、モデル予測に関して実験データで急速に減少する。 Pperk1/2-Y202、Y204の実験データで観察されたプロファイルは、pperk1/2-Y202、Y204とGRB2/SOSの間のフィードバックの強さを増強することによって、より密接に一致 である。 図2(右上のパネル、点線)には、パラメータkcat39(追加ファイル1参照)に10倍を乗じたpperk1/2-Y202、Y204のシミュレートされたプロファイルが示されています。 オンラインで入手可能なRBM ISPモデルでは、モデルのパラメータを変更しないままにすることにしました。 残念ながら、pp70s6k-T389の実験データは信頼性がなかった（唯一の複製が利用可能）ので、我々はIRS1上の重要なフィードバック作用を持つ経路のエンドポイ それにもかかわらず、図に示すシミュレートされたプロフ 図2（下、右パネル）は、他の論文に示されている実験データに似ています。

シミュレーションデータと実験データの比較。 PAkt-S473、pperk1/2、pmTOR-S2448およびpp70s6k-T389の実験濃度（ポイント）と正規化されたモデル予測（ライン）との比較。 ERKとGRB2/SOS間のフィードバックの強さを増加させたpperk1/2-Y202、Y204のプロファイルを点線で示します。 時間にＥＢＳＳ＋１ ０ ０ｎＭインスリンに曝露されたヒト骨格筋細胞（Ｓｋｍｃ）の実験データの値が報告される。0′, 2′, 5′, 10′, 30′, そして60’。 すべての測定は、３つの生物学的複製で行われ、各生物学的複製について、３つの技術的複製された測定が行われた。 すべてのデータは任意の単位(AU)で表され、比較のために0と1の間で再スケーリングされます

すべての活性種の予測プロファイルを調べ、図に示すように、それらの動的挙動に従って四つのクラスターにクラスター化しました。 3:

シミュレーションされたプロファイルのクラスタリング。 四つのクラスターは、その動的挙動に応じて、活性種の予測プロファイルのために同定されました: 1)2-5分以内の定常状態に達する速い応答（青）;2)2-5分以内のピークに達し、10-20分後の定常状態に下降する速いovershooting応答（緑）;3)10-20分以内の定常状態に達す; 4）遅いオーバーシュート応答は5-10分でピークに達し、30-60分で定常状態に下降する（紫色)

1. 2-5分以内の定常状態に達する速い応答（青い)

2. 次に2-5分以内のピークおよび10-20分後の定常状態に達する速いovershooting応答（緑)

3. 応答が遅く、10-20分で定常状態に達します（オレンジ)

4. オーバーシュート応答が遅く、5-10分でピークに達し、30-60分で定常状態に達する（紫色）。

インスリン刺激に続いて、インスリン受容体は、リン酸化し、異なる経路に沿ってイベントのカスケードをトリガすることによ PI3K-AKT経路に沿って、irs1Tyr-リン酸化に密接に関連するすべてのメカニズムは、高速応答によって特徴付けられます。 同じことが、TSC1/2-mTORカスケードに沿ってTyrでリン酸化されたIRS1の他の直接標的、すなわちT172、SHP2-IRS1およびGRB2/SOS-IRS1複合体形成におけるAMPKリン酸化に 高速応答は、標的分子に作用するフィードバック機構の不在/存在に応じて、定常状態への急速な上昇または定常状態条件に続く過渡オーバーシュートによって特徴付けられる（図1および図2、それぞれ青および緑）。 3). 主にTSC1/2-mTOR経路を構成し、Irs1のSer-リン酸化において役割を果たす機構は、比較的遅いオーバーシュート応答によって特徴付けられる（ケース3、図中の橙色）。 3). 上記で観察されたように、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路は、その上流の成分において急速な応答を仮定し、これは下流のものに対して著しく遅くなる（図４の症例４、紫色）。 3).

一般に、転写活性化やERK1/2やGLUT4などの細胞外環境との相互作用などの比較的遅いプロセスに関連する経路の下流の分子は、応答が遅いのに対し、経路の上流の分子は、迅速なシグナル伝播を誘発するように速い応答を特徴とする。 この文脈では、定常状態への復帰に続くオーバーシュート応答は、あるシグナル伝達経路上で迅速なシグナル伝播を達成するのに役立ち、直後に他のシグナル伝達経路で分子を再び利用できるようにするかもしれない。

制御機構がない場合のモデル予測

その後、ISPの二つの標的効果に対するシステムのロバスト性を調査するために、GLUT4転座とERK1/2リン酸化を行った。 特に、ターゲット効果を調節する二つの主要な制御メカニズムの役割を分析しました:

• P70S6K-IRS1負帰還ループ（図中の赤線。 1);

• ERK1/2-GRB2/SOS負帰還ループ（図中の青い線。 1);

この目的のために、上記の２つの調節機構の存在下および非存在下でのＧＬＵＴ４およびＥＲＫ１／２応答の時間経過を比較した（図１）。 4). 二重リン酸化ERK1/2のダイナミック強くP70S6K IRS1とERK1/2GRB2/SOS負帰還ループの両方によって影響されます。 一方、膜中のGLUT4の定常状態と動的挙動はERK1/2の影響を受けませんが、強くP70S6K-IRS1負帰還ループの影響を受け、このようにシステムダイナミク

完全なモデル（黒）、p70s6k-IRS1フィードバックのないモデル（赤）およびERK1/2-GSフィードバックのないモデル（青）との100nMのインシュリンの刺激に、模倣されたpperk1/2-T202-Y204（上のパネル）およびGLUT4膜の集中（下のパネル）プロフィール。 この後者はGLUT4膜の集中に影響を与えません; したがって、ERK1/2-GSフィードバックの有無にかかわらずGLUT4シミュレートされたプロファイ

インスリン抵抗性はIRS依存性シグナル伝達の欠陥と関連しており、代謝疾患の開始および進行におけるその調節不全を関与させることはよく知られている。 新たな見解は、自己経路によるIRSの正/負の調節が減少グルコース取り込みにつながる増加した基礎および他の一時的に不適切なセリン/スレオニンリン 代償性高インスリン血症は、この時点で上昇し、最終的には糖尿病につながる可能性があります。 IRS1（およびIRS2）は、50以上の異なるセリン/スレオニン残基のリン酸化を含む複雑なメカニズムを介して調節されているが、我々のモデルP70S6K-IRS1負帰還ループでは、グルコース取り込みの良好な制御のために不可欠と思われる。 P70S6K-IRS1負帰還ループの強化は、減少したインスリン感受性およびグルコース取り込みを説明することができる（図。 5). 同様に（彼らはまた、mTORから異なるIRS1セリン残基への正のフィードバックを仮定しているが）、Brännmark et al. 、インスリンシグナル伝達の最小モデルを使用して、減少した正帰還機構が減少したグルコース取り込みを説明することができることを示している。

異なるインスリン刺激時に60分でGLUT4膜濃度をシミュレートし、完全なモデル（黒）、p70s6k-IRS1フィードバックのないモデル（赤）と強化されたp70s6k-IRS1)

一方、P70S6K-IRS1とERK1/2-GRB2/SOS負帰還ループの両方が二重リン酸化ERKが一時的な挙動を示すことを保証するために不可欠であると思われ、10分でピーク ベースラインの状態。 この挙動は、インスリン刺激下および表皮成長因子刺激下での文献において既に報告されている。 一過性のＥＲＫ応答は、継続的な細胞増殖をもたらすであろうＥＲＫの持続的な活性化を防止する。

感度解析

ターゲット効果の調節における二つの主要な制御メカニズムの役割をさらに調べるために、小さな摂動（0.一度に一つのモデルパラメータにGLUT4転座およびERK1/2リン酸化の結果として生じる相対的な変化を評価する（方法を参照）。 表1および表2は、モデルパラメータの感度係数を、その絶対値に応じてランク付けし、P70S6K-IRS1およびERK1/2-GRB2/SOS負帰還ループを除去したときに係数が仮定する値と比較したものを示しています。 これらの係数は、結果に対するパラメータ変化、すなわちGLUT4およびERK応答の全体的な効果、すなわち観察窓の間に測定する。 正/負の値は、パラメータ値を増加させると、応答を増強/減少させる効果があることを意味します。 絶対値が小さい場合は、パラメータの変更が結果に有意な影響を与えないことを意味するため、表1および表2では、元のモデルまたは修正されたモデ

GLUT4応答のための完全なモデルのパラメトリック感度分析は、最も敏感なパラメータは、脂質形成とIRS1_PI3K複合体形成/解離に関連するものに続いて、原形質膜へのGLUT4転座に関連していることを明らかにした。 P70s6k_irs1フィードバックの不在は、脂質形成とIRS1_PI3K複合体形成/解離に関連するパラメータの感度（絶対値）を増強する上で強い影響を与えます。

Tyr/SerでのベースラインIRS1リン酸化/脱リン酸化に関連するパラメータは、Serでのirs1リン酸化に関連するパラメータk7pを除いて、P70S6K-IRS1フィー SERでPKC媒介IRS1リン酸化に関連するパラメータはまた、P70S6K-IRS1フィードバックの除去後に増加した値を示しています。 ERK1/2-GRB2/SOSフィードバック除去はGLUT4転座に影響を及ぼさないので、感度係数はこのフィードバックの有無にかかわらず変化しない。

Erk1/2応答の完全なモデルのパラメトリック感度分析は、最も敏感なパラメータがRas、MEKおよびRAF活性化に関連していることを示し、TyrおよびSerでIRS1リン酸化に関連しており、後者はP70s6kによって媒介される。PI3K-AKTおよびRAS-ERK1/2経路の両方に沿って、ERK1/2-GRB2/SOSフィードバックは、システムのロバスト性に重要な役割を果たしているようである。 システムダイナミクスは、その不在によって弱い影響を受けます（図を参照）。 4)、一方、このフィードバックが削除されると、ほとんどすべての場合において、パラメータ感度が（絶対値で）増加する。

P70S6K-IRS1フィードバックがERK1/2応答に及ぼす影響についての結論は、より議論の余地があります。 このフィードバックを除去することは、PI3K_AKT経路に沿ってパラメータ感度を低下させる効果を有するが、RAS-ERK1/2経路に沿って、MEKリン酸化、RAF不活性化およびERKリン酸化に関連するパラメータについてはほとんど効果がない。 それはras、RAFの活発化とIRS1-GRB2/SOSおよびIRS1-SHP2複合体の中断と関連している変数のための感受性を減少します。 それは強くSRCおよびRAFの活発化と関連している変数の感受性を増加します。

これらの結果は、生物学的システムのダイナミクスだけでなく、そのロバスト性を決定する際の負帰還ループの中心的な役割を強調している。 この特性は、一般的に細胞間変動性に起因するノイズおよび小さな生物学的変動に対してシステムの動的挙動を維持するため、顕著に重要である。