臨床手順
VHXとBPDの試験は、タイ北西部のタイ・ミャンマー国境沿いの診療所で、Shoklo Malaria Research Unitによって実施されました18,19。 患者集団には、ブルマン民族とカレン民族の出稼ぎ労働者と避難民が含まれます38。 これらの調査が行なわれた時間の間に、primaquineの根本的な治療の処置はルーチンではなかった。
いずれの研究においても、定期的な訪問時に顕微鏡観察によって再発エピソードが積極的に検出された（検出下限は\(\upmu{\mathrm{{L}}}\)あたり約50寄生虫である）。 患者は、体調不良のときに予定された訪問の間に診療所に来ることが奨励されたので、いくつかの再発が受動的に検出された（5％未満）。 すべての再発は症状に関係なく治療された。
倫理的承認
BPD研究は、マヒドール大学熱帯医学学部倫理委員会（MUTM2011-043、TMEC11-008）とオックスフォード熱帯研究倫理委員会（OXTREC17-11）の両方によって承認され、ClinicalTrials.gov (NCT01640574)。 VHX研究は、マヒドール大学熱帯医学倫理委員会（MUTM2010-006）とオックスフォード熱帯研究倫理委員会（OXTREC04-10）によって倫理的な承認を与えられ、に登録されましたClinicalTrials.gov (NCT01074905)。
Vivax History trial(VHX)
この無作為化比較試験は、2010年5月から2012年10月の間に実施されました。 合計で、644人の6ヶ月以上の患者と顕微鏡検査で7kg以上の重さが確認された複雑でない三日草モノ種感染（三日草のみ）は、アルテスネート（2mg/kg/日5日間）、クロロキン（25mg/kg/日3日間で分割：10、10、および5mg/kg）、またはクロロキン+プリマキン（0.5mg/日/kg/日14日間）を受けるために無作為化された。
G6PD欠損患者（蛍光スポット試験によって決定）は、アルテスネートおよびクロロキン単独療法群にのみ無作為化された。 被験者は、監視された薬物治療のために毎日追跡された。 フォローアップは毎週8週間続き、その後4週間ごとに合計1年間続きました。 顕微鏡検査を受けた患者は、元の割り当てと同じ研究薬で三日熱感染が後退したことを確認した。 9回以上の再発を経験したアルテスネートまたはクロロキン単独療法群の患者は、標準的なprimaquineレジメン（0.5mgベース/kg/日14日間）による根治的治療を受けた。
Best Primaquine Dose trial(BPD)
2012年から2014年にかけて、680人の6ヶ月以上の患者が、同時にプリマキンの二つのレジメン（0.5mg/kg/日、14日間または1mg/kg/日、7日間）と二つの血液期治療のいずれかを比較した四方向無作為化比較試験に登録された。: クロロキン（kgあたり25mg塩基）またはジヒドロアルテミシニン-ピペラキン（ジヒドロアルテミシニン7およびピペラキン55mg/kg）。 すべての用量を監督した。
この試験の包含および除外基準は、蛍光スポット試験によってG6PDが欠損していた場合、ヘマトクリットが25％未満であった場合、または3ヶ月以内に輸血を受けていた場合を除いて、VHX試験と同じであった。
フォローアップ訪問は2週目と4週目に発生し、その後4週ごとに合計1年間行われました。 任意の再発P. 顕微鏡検査（VHXと同じ基準）によって検出されたvivax感染は、クロロキン（25mgベース/kg3日間）とプリマキン（0.5mgベース/kg/日14日間）の標準レジメンで治療された。
マイクロサテライト遺伝子型決定
全血を2mL EDTAチューブ内の静脈穿刺により採取した。 残りの全血を−８ ０℃Ｐで凍結した。 自動ＤＮＡ抽出システムＱｉａｓｙｍｐｈｏｎｙ ＳＰ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＱｉａｓｙｍｐｈｏｎｙ ＤＳＰ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の説明書に従って使用して、１ｍＬの静脈血から、ｖｉｃａｘゲノムＤＮＡを抽出した。 一次感染と再発の遺伝子型パターンを比較するために、我々は非常にきれいな増幅を提供する三つの多型マイクロサテライト遺伝子座を使用して最初に遺伝子型を決定した：スタッターピークはなく、通常、再発感染で見つかった低寄生虫密度でのPCR増幅の信頼性。 これらのコア遺伝子座はＰＶであった。年3月27日-）は、日本の俳優、声優。3.502、およびPV.ms8。 セミテストPCRアプローチは、すべての断片12、39に採用されました。 全ての増幅反応は、全体積10μ l、10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、50mmol/L KCl、各オリゴヌクレオチドプライマー250nmol/L、2.5mmol/L Mgcl2、各125μ mol/Lの四つのデオキシヌクレオシド三リン酸塩、および0.4Uのタカラポリメラーゼ(TaKaRa BIO)の存在下で行った。 一次増幅反応は、血液試料から調製した鋳型ゲノムＤＮＡの２μ ｌを用いて開始し、これらの反応の生成物の１μ ｌを使用して二次増幅反応を開始した。 ＰＣＲのためのサイクリングパラメータは以下の通りであった：９ ５℃で５分間の最初の変性、５ ２℃で３ ０秒のアニーリング、７ ２℃で３ ０秒の伸長、９ ４℃で３ ０秒の変性を行 ＰＣＲ産物を分析まで４℃で保存した。
再発サンプル中の寄生虫の遺伝子型を入学サンプル中の遺伝子型と比較し、サンプルペアにibsに基づく粗分類を割り当てました。 比較全体で別の呼び出しと同一の呼び出しが含まれている場合、ヘテロアレリック呼び出しにはIBSの証拠がありました。 対になったサンプルが大多数のIBに基づいて関連するものとして分類された場合、または初期遺伝子座の1つ以上が増幅に失敗した場合、6つの追加の(非コア)マイクロサテライトマーカーが遺伝子型化された(PV.1.501,PV.ms1,PV.ms5,PV.ms6,PV.ms7,PV.ms16).各マイクロサテライトについて、モチーフ、染色体、位置などの詳細は補足表3に記載されています。 追加のマーカーの数によって分割されたエピソードの数は、補足表4に示されています。 追加のマーカーが再発推論に偏りがあるかどうかを確認するために、null遺伝子データで推論された再発の確率を、再発の確率を推定するために使用されたマーカーの数で分割しました。 追加のマーカーは再発推論にバイアスを与えない：再発の確率は、1つから3つのマーカーで前から減少し、その後0.25前後で安定する（補足図）。 5).
マイクロサテライトを呼び出す対立遺伝子のために、PCR産物の長さは、対立遺伝子の長さを測定し、ピーク高さを定量するためにGENESCANとGENOTYPERソフトウェア（Applied Biosystems）を使用して、ABI3100Genetic analyzer（PE Applied Biosystems）上の内部サイズ標準（Genescan500LIZ）と比較して測定した。 複数の対立遺伝子は、遺伝子座ごとに複数のピークがあり、マイナーなピークがあった場合に呼び出されました\(> 33 \%\) 優勢な対立遺伝子の高さの。 本発明者らは、各増幅実行に陰性対照試料（ヒトＤＮＡまたは鋳型なし）を含めた。 得られた結果の一貫性を確認するために、サンプルのサブセット（n=10）を三重に分析した。 プライマーのすべてのペアは、P.falciparumまたはヒトからのゲノムDNAを使用して特異性について試験した。
三日熱マラリア再発のイベントまでの時間モデル
vhxおよびBPD研究における再発三日熱マラリア感染のために、我々は開発し、投与された治療薬 最初のモデル（モデル1）は、根治治療後に再感染のみが可能な高用量プリマキンの100％の有効性を仮定した。 第二のモデル（モデル2）は、高用量プリマキン後の再発および再燃を可能にした。 両方のモデルに関連する仮定の完全なリストは、補足表5に記載されています。 モデル1は、堅牢性を評価するためのベースモデルとして機能しました。 モデル2を最終モデルとして使用し、報告されたすべての推定値はそれから導出されます。 記法は、遺伝モデルの数学的記法と一致するように選択された（下記参照）。 モデル表記では、\(n\)に続くのはインデックスですが、上記ではカウントを示すために使用されます。 添字\(n\in1..N\)、我々は、連続するp.vivaxエピソードの間の時間間隔（日単位）を記録する（登録エピソードはエピソード0と表記される）。 最後の時間間隔は、フォローアップの最後に検閲されます。 モデルは、損失からフォローアップまでの選択バイアスを想定していません。 時間間隔\(t\)に関するデータ（エピソード\(t-1\)とエピソード\(t\)の間の時間）は、\({{\boldsymbol{x}}}_{n}={(t)}\)={\({D}_{n}t{t},{Z}_{n}t{t},{C}_{N}t{t},{S}_{N}t{t},{S}_{n}t{t},{S}_{n}t{t},{S}_{n}={t},{S}_{n}={t},{S}_{n}={t},{S}_{n}={t},{S}_{n}={t},{S}_{n}={t},{S}_{n}={t},{S}_{n}={t},{S}_{n}={t},{S}_{n}={t}ここで、\({d}_{n}in{t}\in\{{\rm{as}},{\rm{cq}},{\rm{pmq}}+\}\)は、エピソード\(t-1\)を治療するために使用される薬物の組み合わせである（AS：アルテスネート単剤療法;CQ：クロロキン単剤療法;PMQ\({}^{+}\): プリマキンプラス血期治療）、\({Z}_{n}^{t}\)は日数単位の時間間隔、\({C}_{n}^{t}\in\{0,1\}\)は間隔が打ち切りされたかどうかを示し、1は右打ち切り観察に対応し（すなわち、次の再発が観察される前にフォローアップが終了した）、0は観察された再発感染に対応し、\({S}_{n}\)は患者が募集された研究を示している（1：VHX、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、2：vhx、bpd）。 一般に、\({{\boldsymbol{x}}}_{n})とする}\) = {\({{\{{\boldsymbol{x}}}_{n}.{(0)},\ldots,{{\boldsymbol{x}}}_{n}.{(T)}\)}は、\({n}{{\mathrm{{th}}}}\)個体の利用可能なすべてのイベントまでの時間データを表します。 いくつかの再発（八）は、BPD試験のジヒドロアルテミシニン-ピペラキンアームに無作為化された患者のための最初の8週間で発生したので、我々はクロロキン（すな\({}^{+}\) 血段階の処置としてクロロキンおよびdihydroartemisininピペラキンを両方含んでいます）。 実際には、除去プロファイルと本質的な活動はわずかに異なり、ピペラキンはクロロキンよりもわずかに長い無性段階の抑制を提供する。
どちらのモデルでも、再発までの時間は4つの分布の混合としてモデル化され、混合重みは前のエピソードの処理に依存します。 混合分布は、異なる再発状態に対応します。 4つの混合物は次のとおりである:指数分布によって与えられる再感染;早い(周期的な)再発、処置の薬剤依存した変数が付いているワイブルの配分によ; 指数分布によって与えられる遅い（一定速度の）再発;再燃、指数分布によって与えられる。 モデル2では、非プリマキン群とプリマキン群の再感染成分について、それぞれ異なる混合比率を指定しています。\({p}_{n}^{{\rm{AS}}}={p}_{n}^{{\rm{CQ}}}\)と\({p}_{n}^{{\rm{PMQ+}}}\)。 再発成分内の早期/周期的および後期/定率再発の間の混合割合は、プリマキン群および非プリマキン群で同じである。
モデル2の尤度は次のように与えられます
ここで、\({p}_{n}in{(\cdot)}\in(0,1)\)は、再感染の個体および薬物特異的混合確率である（我々は、\({p}_{n}={{\rm{AS}}}={p}_{n}
モデル1の尤度は、\({p}_{n}^{{\rm{PMQ+}}}=1\)であることを除いて同じです（再感染のみ可能）。 \({\mathcal{E}}(\cdot)\)は指数分布を表します。 両方のモデルにおいて、\({\lambda}_{{S}_{n}}\)は研究固有の再感染率です。 \({\Lambda}_{1}\)と\({\lambda}_{2}\)の関係は、\({\lambda}_{2}=\delta{\lambda}_{1}\)と\(\delta\)に先験的に指定されています。 \(\delta\)は、VHXとBPDスタディ期間の間の伝送の減少を指定しました。 \({\lambda}_{{\rm{RC}}}\)は再発病率(薬物非依存性と仮定)です。 \({c}.{{D}_{n}t{t}}\)は、再燃と再発の間の薬物依存性のネストされた混合割合です。 再発までの時間は、それ自体が混合分布であり、\(q\)は、初期（第1成分）と後期（第2成分）の再発の間の二重にネストされた混合割合です。\(q\)は、\(q\) これは、すべての個人間で一定の割合です。 後期/定率再発は、速度定数\(\gamma\)によってパラメータ化されます。 初期の再発はワイブル分布であると仮定され、薬物依存のスケールパラメータ\({\mu}_{{D}_{n}t{t}}\)と形状パラメータ\({k}_{{D}_{n}t{t}}\)によって\({\mu}_{{\rm{CQ}}}={\mu}_{{\rm{PMQ+}}}\)と\({\mathcal{W}}(\cdot,\cdot)\)で表される。（{k}_{{\rm{cq}}}={k}_{{\rm{pmq+}}}\）。
再感染の個々の限界確率は\({p}_{n}.{{D}_{n}t{t}}\)で与えられ、再発生の個々の限界確率は\(\left{c}c{{D}_{n}t{t}}\)で与えられ、再発の個々の限界確率は\(\left\left\)で与えられる。
我々は、混合成分の同定可能性を確保するために、有益な事前分布（補足表1）を使用した。 前に指定された以上のデータ内の情報内容を、前から事後のプロットを使用して視覚的に調べた。 モデル2の前から後のプロットは、補足図に示されています。 6. パラメータの同定可能性をシミュレーションにより決定した。 モデル1とモデル2で定義された各データ生成プロセスと、季節的な再感染を組み込んだモデル2の修正バージョンから、五十の合成データセットが引き出された。 季節成分は，ＢＰＤおよびＶＨＸ研究における入学週の経験的分布から推定した。 モデルをこれらのシミュレートされたデータセットに適合させ，推定パラメータをシミュレーション真実パラメータと比較した。 補足図。 図7は、モデル2の下で生成されたデータ(適切に指定されたモデル適合)およびモデル2の季節バージョン(誤った指定されたモデル適合)の下で生成されたデー 季節的な再感染は、故障率のわずかな過大評価をもたらす。 事後モデルのチェックは、最終的なモデル適合の事後予測分布の下で500の合成イベントまでの時間データセットをシミュレートすることによって行 各処置群についての一人当たりの年当たりの再発数を、事後予測ｐ値を計算するために使用される要約統計として選択した（補足図１ ４Ａ）。 7).
stanモデル出力(i)すべてのモデルパラメータのモンテカルロ事後分布;(ii)各時間間隔\({{\boldsymbol{x}}}_{n}^{(t)}\)の再発状態の事後推定;(iii)各事後ドローの対数尤度推定。 各モデルのために、私達はとの八つの鎖を動かしました\(1{0}^{5}\) 反復、400回の反復ごとに間引き、バーンインのために半分を破棄します。 ＭＣＭＣ鎖の収束は，八つの独立した鎖の混合と一致を評価するトレースプロットを用いて評価した。 これらの分析はすべて、オンラインのgithubリポジトリで複製できます。
対立遺伝子の頻度と有効基数
各マイクロサテライト遺伝子型について、対立遺伝子の頻度は、登録エピソード（137VHX、79BPD）と多項ディリクレモデル（補 8). 各マーカーについて、等周波数対立遺伝子頻度が与えられた偶然によって同一性の同じ確率を提供する対立遺伝子の数として定義された有効基数\({n}.{*}\)は、平方された対立遺伝子頻度の合計に対して1として推定された40。 有効基数から、9つのマイクロサテライトが次のように同一視する仮想的なバイアレリックSnpの数を計算することができます:
ここで、\(m\)は\(M=9\)超小型衛星の指数であり、対数は底\({n}_{{\rm{SNP}})です}}}^{* }\), 仮説的なSNPの仮定された平均有効基数。 これは、理想的なSNPの場合は2、現実的なSNP40の場合は約1.5です。
遺伝子モデル
遺伝子モデルは、pが再発する確率を出力します。 (1)エピソードが再燃、再発、または再感染であるという事前確率(この研究では、イベントまでの時間データに基づいています);(2)集団レベルの対立遺伝子頻度推定値のセット;(3)最大で9つのポリアレリックマイクロサテライトマーカーを持つ特定の個人の観察されたエピソードのための利用可能な遺伝データ。 （1）と（2）の不確実性を伝播するために、我々は、時間からイベントモデルと各マーカーの対立遺伝子周波数にわたって後部ディリクレ分布から100モンテカルロ 遺伝子モデルは、遺伝子型マーカーの数の変動による不確実性を捕捉しない。 それにもかかわらず、遺伝モデルは限られたデータを過度に解釈しません：遺伝子型マーカーが少ない場合、それは単に以前に近い推定値を返します。 このセクションの残りの部分では、モデルの非公式の説明を提供します。 仮定のリストと完全な数学的仕様の詳細な説明は、補足的な方法にあります。
特定の個体について、感染の中および全体の寄生虫は、互いに関連して見知らぬ人、兄弟、またはクローンのいずれかであると考えられています（見知らぬ人とは、単一の蚊を超えて祖先が共有されているすべての寄生虫を指します）。 寄生虫間の関係のセットは、完全に接続されたグラフで表すことができます。 各頂点は一倍体遺伝子型を表し、遺伝子型間の各エッジは、遺伝子型が同じ感染内に含まれている場合は兄弟または見知らぬ人として、遺伝子型が異 複雑な感染症の場合、頂点の数は、観察されたマーカーあたりの対立遺伝子の最大数として定義されるCOIに等しく設定されます。
このモデルでは、感染（見知らぬ人、兄弟、クローン）間のすべての寄生虫間関係に対して再発が起こりうるが、再感染は見知らぬ人としてのみ起こり、再感染はクローンとしてのみ起こると仮定している。 モデルの重要な手順は次のとおりです。 まず，ラベル付けされた関係グラフを与えられた遺伝子データの確率を計算した。 次に，再発エピソードが再燃，再発，再感染であると仮定して，提案したグラフの確率を計算した。 第三に、我々はすべての可能なグラフを合計します。 標識されたグラフのセットには、マイクロサテライトデータを位相化するためのすべての可能な方法（すなわち、複雑な感染症における一倍体遺伝子型に 例えば、遺伝子型ＡがＢのクローンであり、ＢがＣのクローンである場合、ＡとＣとの間の唯一の実行可能な関係はクローンである。
最初のステップでの関連性（IBDの確率）の特徴の概念。 ただし、このモデルは関連性を推定しません。 代わりに、IBDが与えられたデータを観察する確率に、指定された関係に関する条件付きIBDの確率を掛けたものを推定します（例：異系集団の兄弟の場合は0.5）。 この計算は、対立遺伝子頻度を使用する（共有された共通の対立遺伝子は同一でありがちであるが、必ずしも下降によるものではないが、共有された希 次に、2つの可能なIBDシナリオ（対立遺伝子がIBDであるかどうか）を合計して、指定された関係を条件とした観測データの確率を取得します,
これは、関係グラフ内のすべてのペアワイズ関係に対して計算されます(詳細については、補足メソッドを参照してください)。
遺伝子モデルの計算の複雑さは、患者ごとに3つのエピソード（2つの再発）の共同分析に制限されます（私たちのデータでは、これは158人の患者の場合です）。 二つ以上の再発（54患者）を持つ個々のために、我々は（上記のモデルを使用して）エピソード間の再発状態のペアワイズ確率を推定し、隣接行列を構築しました。 再発確率は、先行するすべてのエピソードに関する再発の最大推定確率と、直前のエピソードに関する再燃の推定確率に比例するものとして定義された。 再感染の確率は、再発の確率と再燃の確率の補数である。 その後、これらの確率を再重み付けして合計を1にしました。
遺伝子シミュレーション
我々は、反復状態推論のためのマーカー要件を探索するためにシミュレーションを使用しました。 上記のように、3から12の独立したマイクロサテライトマーカーに関するデータは、三つのシナリオの下でペアの感染症（単一の再発に続いて一つのプライマリエピソード）のためにシミュレートされた：再発は、一次感染における一倍体寄生虫の遺伝子型の兄弟、見知らぬ人、またはクローンのいずれかである一倍体寄生虫の遺伝子型が含まれています。 シミュレートされたデータは、再発状態（すなわち、再燃、再感染および再発は、それぞれ三分の一の事前確率を有する）にわたって均一な事前を仮定して分析した。 見知らぬ人、兄弟とクローンのシナリオのそれぞれについて、我々はそれぞれのCOIsとの初期および再発感染のためのデータをシミュレートしました1 & 1, 2 & 1, 1&2と、エラーの有無にかかわらず、それぞれのCOIs3&1と、エラーのない。 誤ったデータに適用した場合のモデルの動作を説明するために、エラーのあるデータは、非常に高い軌跡ごとのエラー確率（現実的なエラーに対して0.2）を使用\(<\ 0.01\)41). COIsが一つを超えたとき、兄弟、ストレンジャー、またはクローンは、無関係なストレンジャー一倍体遺伝子型（最大で単一の非ストレンジャーエッジとの関係グラフ）の中にあった。 与えられたCoiのセットでは、このタイプのグラフは非常に多様なデータを生成するため、分析するのが最も困難です。 1または2のCOIsと非誤ったエピソードのために、我々は13と4（平均と最小、それぞれ、九マイクロサテライトの私たちのパネルの）の基数を検討しました。 誤ったデータとCOIsが3&1のエピソードについては、13に等しい基数のみを使用しました。 遺伝的シミュレーションの例示的なサブセットの結果を図１ ０に示す。 図5および補足図。 3と4。 すべての遺伝的シミュレーションは、オンラインgithubリポジトリから複製することができます。
再発エピソードの分類
遺伝モデルの偽障害発見率の推定と図。 4両方とも、分類境界の指定を必要とする。 この区間を不確実性のゾーンとして任意に選択しました。 それぞれの再発は、再感染または失敗として分類され、失敗が再発または再発のいずれかである場合：再発の上部の信頼できる間隔と再発の合計が0.3未満の場合、再発は再感染として分類され、再発の下部の信頼できる間隔と再発の合計が0.7を超える場合、再発は失敗として分類され、そうでなければ分類は不確実であるとみなされる。 再燃の証拠はごくわずかであったので、すべての失敗は本質的に再発である。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryを参照してください。