二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE):advances and perspectives

Introduction

過去25年間、特に過去十年間は、疾患バイオマーカーの検出、タンパク質回路のマッピング、新規リン酸化部位の同定などを期待して、細胞系（すなわちプロテオーム）内で発現する多数のタンパク質を同定および定量する技術の開発に取り組んできました。 プロテオームの複雑さは、タンパク質の効率的な分離と敏感な検出のための方法を開発し、この努力の重要なコンポーネントになりました。 質量分析（MS）技術の継続的な進歩は、以前に可能なよりもはるかに大きな速度と感度でタンパク質の検出を可能にしています。 しかし、最先端のMSでさえ、複雑なプロテオーム内のすべての成分を特徴付けることはできません。 科学者たちは、質量分析計が分析するように求められるタンパク質の数を時間的に制限しようとするという点で、プロテオームを特徴付けるために”分 プロテオームを広げることにより、最終的には個々の実験内でより多くのタンパク質が分析されます。

プロテオームを分離するために、科学者は電気泳動技術とクロマトグラフ技術を別々に組み合わせて、オフラインとオンラインの両方で使用しています。 これらの努力は何千ものタンパク質の分離と同定をもたらす可能性があるが、その数と濃度のダイナミックレンジが大きいため、プロテオーム内のすべてのタンパク質を単一の方法で解決することはできない。 単一次元の分離は、複雑なタンパク質混合物を効果的に解決するには不十分である。 この事実は半世紀以上前にSmithiesとPoulik（1）によって認められ、ゲル上の2つの電気泳動プロセスを直角に組み合わせると、別々のいずれかで可能なよりもはるかに大きな分解能を与えるはずであることを認識した。 二つの電気泳動プロセスは分子サイズによる分解能と澱粉ゲル上の自由溶液移動度である。 それらの予測は真実であり続け、ゲル電気泳動だけでなく、クロマトグラフィーおよびキャピラリー電気泳動による複雑な混合物の分離のための直交多次元方法論を開発するための基礎を形成している。

二次元ページ（二次元ページ）の進歩を正しく理解するためには、四半世紀以上にさかのぼる必要があります。 1930年、Tiseliusはタンパク質の電気泳動を研究するための分析ツールとしてmoving boundary法を導入しました(2)。 彼の先駆的な研究以来、様々な形態の電気泳動が、タンパク質の複雑な混合物の分離に使用されており、それぞれが改善された分解能を有する。 1962年には早くも、RaymondとAurell(3)は、血清タンパク質を分離するために異なるアクリルアミドゲル濃度を用いた2次元電気泳動を採用することにより、タンパク質の電気泳動移動度にゲル濃度の有意な非線形効果を示した。 二年後、レイモンド(4)は、円筒管ゲルと比較して平らなスラブゲルの優位性を実証しました。 例えば、平らな平板はゲルを冷却するために最高の表面積を提供する;得られるパターンは標準的な記録のdensitometersで量を示すこと容易である;多数のサンプルは同一の条件の下で処理される標本の直接比較を促進する単一のゲルの版を使用して処理することができる;そして、最も重大に、平らな平板は2-D分離の適用を可能にする。 これらの洞察に満ちた好みは本当証明され、多くのbioanalytical実験室で今日練習される。

2次元ゲル分離のもう一つの進歩は、1972年にWright(5)によって導入され、4.75%(2%cross-linkage)のポリアクリルアミドゲルカラムを最初の次元で使用し、ガラスシリンダーから除去し、2%勾配スラブの上端に敷設した。 電気泳動に続いて、ゲルスラブを染色溶液中に置き、112個の分解ヒト血清タンパク質の可視化をもたらした。

これらの新規アプローチは、主に細胞または血清プロテオームの最も豊富なタンパク質である少数のタンパク質のみを解決した。 変性条件下で細胞タンパク質を分離するためのオファレル（6）によって1975年に2D-PAGEの導入は、タンパク質の数百の解像度を可能にしました。 適用された原理は非常に簡単でした: 蛋白質を等電点に応じて第一次元の蛋白質を分離する等電点集束（ＩＥＦ）を用いてゲル上で分解し，次いで分子量に応じて蛋白質を分離するドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で第二次元の電気泳動を行った。 O’Farrellの方法は、現代の2Dページの基礎であり、他の研究者によって迅速に適応され、広く受け入れられました。 AndersonとAnderson(7)は、ヒト血漿タンパク質の分析に2D-PAGEを使用しました。 彼らは、染色時に約300の異なるタンパク質スポットを分離し、検出することができた。 O’Farrellとは異なり、真鍋(8)は変性剤なしで2D-PAGEを用いてヒト血漿タンパク質を分離した。 ゲル上には約230個のタンパク質スポットが観察されたが、スポットは塗抹され、よく解決されなかった。

固定化されたpH勾配の導入

上記のように、2D-PAGEは、第一の次元にIEFを含み、第二の次元にSDS-PAGEを含む。 1954年9月にコリンによって導入されて以来、IEFはいくつかの進歩を遂げてきた。 最初の次元はガラスかプラスチック管で形作られ、電界のpHの勾配を形作る両性岩を含んでいるpolyacrylamideのゲルの棒で遂行される。 これらのロッドは歴史的に生産不可能で、不安定で、作業が困難でした。 Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔらによる固定化ｐＨ勾配（Ｉｐｇ）の導入。 (10)広いpH範囲にわたって複雑な混合物を分離するためにIEFの使用に大きな影響を与えました。 Ｉｐｇは，広いｐ ｈ勾配で調製した単一のゲル上に酸性および塩基性タンパク質を集中させることができる安定で再現性のあるｐ ｈ勾配の形成を可能にした。 IPGsでは、キャリア両性岩はアクリルアミド分子に結合し、固定pH勾配を形成するためにゲルにキャストされます。 勾配を固定することはゲルの漂流を防ぎ、またそれらが有効で、再生可能な方法で投げることができることを保障する。 狭い範囲のIPGストリップを使用すると、狭いpH範囲がより大きな物理的距離にわたって広がっていたので、標準的な2D-PAGEで可能であったよりも多 この広がりは、同様の等電点（pI）値を有するタンパク質をより高い分解能で分離することを可能にした。 この点を説明するために、Ｈｏｖｉｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ． 彼らは最初の次元（11）で狭範囲IPGストリップを適用した2Dページ法を開発しました。 IPGストリップは、典型的には1-3pH U幅であり、少なくとも0.5pH Uによって互いに重なっていた。3.5-10のpH範囲をカバーする六つのIPGストリップが使 Ｂリンパ腫細胞株からの蛋白質を各ストリップに適用し，ＩＥＦを用いて分離した。 次に、各ストリップを個々のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルプレートに適用し、タンパク質を、それらの分子量に基づいて第２次元で分離した。 およそ5000の明瞭な点は1500の点が3-10のpHの範囲および単一の標準的な2Dページのゲルの版の単一のIPGのストリップを使用して検出されたと比較された六つのIPGのストリップを使用して検出された。 Wildgruber et al. (12)3IPGストリップ4–5、5-6、および5.5-6.7のpH勾配範囲3-10および4-7のIPGストリップで実行ゲルに対してのph範囲との使用を比較しました。 彼らは、それぞれ二つの広い勾配範囲IPGストリップ（3-10と4-7）よりも三つの狭い範囲IPGストリップを使用して2.3と1.6倍以上のタンパク質スポットを検出することができた。

複数の重複する狭いIpgを使用して得られるより高い解像度は、より多くのタンパク質の同定を可能にするが、それぞれの狭いストリップは、別々のゲルプレートと、それぞれにロードされる同じサンプルの一定量を必要とする。 この要件は、試料の体積または濃度が制限されている場合、そのような実験は不可能である可能性があることを意味する。 限られたサンプルのために、Ipgのより広いpHの範囲か最小数は考慮されるべきです。

二次元差動インゲル電気泳動（2D-DIGE）

2D-PAGEを用いたタンパク質の分離の目的は二重です: (i)新しい蛋白質を識別し、(ii)比較サンプル間の相対的な存在量を測定する。 分離技術としての2D-PAGEの利点の1つは、大量のタンパク質を分解するだけでなく、これらのタンパク質を染色することで、タンパク質の相対的な 例えば、2つの血清試料（健康および罹患）から抽出されたタンパク質は、それぞれ別々のゲルプレート上に装填される。 染色後、タンパク質スポットを整列させ、それらの個々の強度を測定するためにスキャンする。 ソフトウェアアライメントツールの多くの進歩がなされていますが、二つの別々のゲル間の直接スポット間の比較を確実にすることは困難でした。 1997年の2次元差動インゲル電気泳動（DIGE）の開発は、単一の2Dページゲル（13）内で分離する三つまでの異なるタンパク質混合物を可能にすることによって、この制限を克服した。 典型的な2D-DIGE実験では、健康、病気、および内部制御（健康と病気のサンプルから抽出されたタンパク質の等量を混合して形成されたプールされたサ サンプルは、いずれかの染料で標識された同じタンパク質がゲル上の同じ位置に移動するように、移動整合されている。 使用されているシアニン染料は次のとおりです: １−（５−カルボキシペンチル）−１’−プロピルインドカルバシアニンハライドＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル（Ｃｙ３）；１−（５−カルボキシペンチル）−１’−メチルインドジカルバシアニンハライドＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル（Ｃｙ５）；および３−（４−カルボキシメチル）フェニルメチル−３’−エチルオキサカルバシアニンハライドｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル（ｃｙ２）。 異なって分類された蛋白質および対照サンプルの等しい集中は混合され、単一のゲルの版に適用され、そして2D-PAGEを使用して分かれています。 対照サンプルは内部標準として役立ち、相互および内部ゲルの一致を可能にする。 対照サンプルには、実験内のすべてのサンプルに存在するすべてのタンパク質が含まれている必要があります。 これは実験のあらゆる蛋白質に各ゲル内の直接量的な比較のために使用され、ゲル間の各蛋白質のための量的な存在量の価値を正規化する内部標 蛍光イメージャを使用して各色素の特定の励起波長でゲルを走査することにより、特異的に標識されたタンパク質の可視化が可能になります（図1）。 画像は、その後、比較するタンパク質の存在量レベルの違いを可能にするイメージングソフトウェアを使用してマージされ、分析されます。 DIGEの価値はゲルのミスアラインメントと関連している間違いを除去し、正確なquantitationを保障する(14)。

目的のタンパク質は、ゲルから切除され、タンパク質分解消化され、MSを用いて同定される。 それは単一のゲルの版を使用して行われるので、2D-DIGEはそれを比較すること容易およびより正確にイメージ化する蛋白質の2つのサンプル間の蛋白質の表現のより経済的そして相違させる50%の少数のゲルを要求する。 さらに、DIGEでの標識反応は染色法を用いた可視化よりも高速であるため、タンパク質スポットの検出に要する時間が短縮されます。 2つの異なるサンプルのタンパク質発現レベルを比較する必要がある場合、DIGEは選択方法である（15）。

2Dページの長所と短所

電気泳動は、解像度、検出、定量、再現性を向上させたいくつかの進歩を遂げた確立された技術です。 蛋白質の側面図を描くことへの2D SDS-PAGEおよび2D-DIGEのアプローチは高い解像力を所有し、何百もの単一のゲルの版の蛋白質の検出を可能にする入手しやすく、経済的な方法である。 再現性は2D-PAGEで問題となっていましたが、特に2つのタンパク質混合物をプロファイリングする場合、2D-DIGEの使用により大幅に改善されました。 分析者が狭いpHの勾配の範囲が付いているultrazoomのゲルを使用して最高の決断のためのpHの勾配を合わせることを可能にするIPGsの導入によって解 現代の2D-PAGEでは、pIが0.001Uで異なる二つのタンパク質を解決することは珍しいことではありません。

2D-PAGEは、塩基性または酸性、大きすぎる、または小さすぎるタンパク質を解決することができないことによって制限されていますが、この制限は継続的に減少しています。 例えば、塩基性タンパク質の分離は、４〜１ ２のｐＨ範囲のＩｐｇを用いて分析することができる。 分離科学は常に進化しており、ゲル電気泳動の残りの問題が適切に解決されるまでにはそれほど長くはありません。

2D-DIGEの導入は、再現性と定量化の問題を解決するために非常に貢献しました。 イメージャとコンピュータを使用すると、高速なデータマイニング、取得、分析だけでなく、スポット検出、正規化、タンパク質プロファイリング、バックグラウンド補正、データのレポートとエクスポートも可能になります。 分離、検出およびquantitationの技術として、2D-DIGEは蛋白質の表現のレベルおよび病気のbiomarkerの発見の決定にかかわる臨床実験室のための重要な用具、特にである。 バイオマーカーの発見のように、サンプル間の絶対的な生物学的変動が主な目的である場合、2D-DIGEが選択される方法です。

MS分析とオンラインで直接分画法を結合するためのnongel（または溶液ベース）法には大きな進歩がありましたが、2D-PAGEはプロテオーム研究を行うための一般的な手法であり続けています。 2D-PAGEは、任意の分画スキームのように、その長所と短所を持っていますが、それは今後何年もの間、プロテオームの特性評価のための不可欠な技術のまま