2 차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(2 차원 페이지):진보와 전망

소개

지난 25 년,특히 지난 10 년 동안,질병 바이오마커를 검출하거나,단백질 회로를 매핑하거나,예를 들어 새로운 인산화 부위를 식별하기 위해 세포 시스템(즉,프로테옴)내에서 발현되는 많은 수의 단백질을 식별하고 정량화할 수 있는 기술을 개발하기 위한 노력이 증가하였다. 프로테옴의 복잡성은 효율적인 분리 및 단백질의 민감한 검출이 노력의 중요 한 구성 요소에 대 한 방법을 개발 했다. 질량 분석(미시시피)기술에 있는 계속적인 전진은 이전에 가능한 보다는 매우 더 중대한 속도 그리고 감도를 가진 단백질의 탐지를 가능하게 했습니다. 심지어 최첨단 밀리,그러나,복잡한 프로테옴 내의 모든 구성 요소를 특성화 할 수 없습니다. 과학자들은 질량 분석기가 분석하도록 요청받는 단백질의 수를 일시적으로 제한하려고 시도한다는 점에서 프로테옴을 특성화하는”분할 및 정복”접근 방식을 취합니다. 프로테옴을 확산시킴으로써 더 많은 단백질이 궁극적으로 개별 실험 내에서 분석 될 것입니다.

프로테옴을 분리하기 위해 과학자들은 전기 영동 및 크로마토 그래피 기술을 개별적으로 그리고 조합하여 오프라인과 온라인으로 사용했습니다. 이러한 노력 분리 및 단백질의 수천의 식별 될 수 있습니다,비록 단일 방법 그들의 많은 수와 농도 동적 범위로 인해 프로테옴에 있는 모든 단백질을 해결할 수 있습니다. 단 하나 차원 별거는 효과적으로 복잡한 단백질 혼합물을 결심하기를 위해 부적당합니다. 이 사실은 반세기 전에 스미시스와 풀릭(1)에 의해 인정되었는데,그는 직각으로 젤에 두 개의 전기 영동 과정을 조합하면 개별적으로 가능한 것보다 훨씬 더 큰 해상도를 제공해야한다는 것을 인식했습니다. 2 개의 전기 이동 과정은 전분 젤에 분자 크기 그리고 자유로운 해결책 기동성에 의하여 해결책입니다. 그들의 예측 사실 입증 계속 하 고 젤 전기 이동 법에 의해 뿐만 아니라 크로마토그래피 및 모 세관 전기 이동 법에 의해 복잡 한 혼합물의 분리에 대 한 직교 다차원 방법론을 개발 하기 위한 기초를 형성 하고있다.

2 차원 페이지(2 차원 페이지)에서 이루어진 진보를 제대로 이해하려면,1/4 세기보다 훨씬 더 거슬러 올라갈 필요가 있다. 1930 년 티셀리우스는 단백질의 전기영동 연구를 위한 분석 도구로서 이동 경계 방법을 도입했다(2). 그의 선구적인 작업 이후,다양한 형태의 전기 영동은 각각 향상된 해상도로 단백질의 복잡한 혼합물을 분리하는 데 사용되었습니다. 1962 년 초,레이 몬 드와 아 렐 렐(3)혈청 단백질을 분리 하는 다른 아크릴 아미드 젤 농도를 사용 하 여 2 차원 전기 영동을 사용 하 여 단백질의 전기 영동 이동성에 젤 농도의 중요 한 비선형 효과 시연 했다. 2 년 후,레이몬드(4)는 원통형 튜브 젤에 비해 평면 슬래브 젤의 우수성을 입증했습니다. 예를 들면,편평한 석판은 젤 냉각을 최대 표면적을 제공합니다;유래 본은 표준 기록 농도계에서 양을 재기 쉽습니다;동일한 조건 하에서 가공된 견본의 직접적인 비교를 촉진하는 단 하나 젤 판을 사용하여 많은 표본 가공될 수 있습니다;그리고,가장 중요하게,편평한 석판은 2 차원 별거의 신청을 허용합니다. 이러한 통찰력있는 선호도는 사실로 입증되었으며 오늘날 많은 생물 분석 실험실에서 시행되고 있습니다.

2 차원 겔 분리의 또 다른 발전은 1972 년에 라이트(5)에 의해 도입되었는데,그는 4.75%(2%가교 결합)폴리 아크릴 아미드 겔 컬럼을 첫 번째 차원에서 사용했으며,유리 실린더에서 제거하고 2%그라디언트 슬래브의 상단 가장자리에 놓았습니다. 전기 이동법 다음,젤 석판은 112 의 결심된 인간적인 혈청 단백질의 구상의 결과로 얼룩이 지는 해결책에서,두었다.

이러한 새로운 접근 방식은 소수의 단백질,주로 세포 또는 혈청 프로테옴의 가장 풍부한 단백질만을 해결했습니다. 변성 조건 하에서 세포 단백질 분리에 대 한 오 패럴(6)에 의해 1975 년에 2 페이지의 도입 단백질의 수백의 해상도 활성화. 적용된 원리는 매우 간단했습니다: 1 차원에서의 단백질 분리 그들의 분자 질량에 따라 단백질을 분리 하는 나트륨 도 데 실 황산염의 존재 하에서 2 차원에서의 전기 영동에 의해 그들의 등전점에 따라 첫 번째 차원에서 단백질을 분리 하는 겔에 해결 했다. 오 패럴의 방법은 진정으로 신속하게 적응하고 널리 다른 연구자들에 의해 받아 들여졌다 현대 2 차원 페이지의 기초입니다. 앤더슨과 앤더슨(7)은 인간 혈장 단백질의 분석을 위해 2 차원 페이지를 사용했다. 그들은 염색시 약 300 개의 뚜렷한 단백질 반점을 분리하고 검출 할 수있었습니다. 오 패럴과는 달리,마나베(8)는 변성제없이 2 차원 페이지를 사용하여 인간 혈장 단백질을 분리했다. 약 230 단백질 관광 명소 젤;에 관찰 될 수 있었다 그러나,관광 명소 지저분 하 고 잘 해결 되지.

고정화된 산도 구배의 소개

위에서 언급한 바와 같이,2 차원 페이지는 제 1 차원에서는 아이에프,2 차원에서는 아이에프,2 차원에서는 아이에프,2 차원에서는 아이에프,2 차원에서는 아이에프,2 차원에서는 아이에프,2 차원에서는 아이에프,2 차원에서는 아이에프,2 차원에서는 아이에프 페이지를 포함한다. 1954 년(9)에 콜린에 의해 도입 된 이후,이 프로그램은 몇 가지 발전을 겪고있다. 첫번째 차원은 유리 또는 플라스틱 관에서 형성되고 전기장에 있는 산도 기온변화도를 형성하는 양각제를 포함하는 폴리아크릴아미드 젤 막대에서 실행됩니다. 이 막대는 역사적으로 반복 할 수없고 불안정하며 작업하기가 어려웠습니다. 비옐크비스트 등의 고정화된 산도 구배의 도입. (10)는 광범위 한 산도 범위에 걸쳐 복잡 한 혼합물을 분리 하 여의 사용에 중요 한 영향을 미쳤다. 산도 그라디언트 광범위 한 산도 그라디언트와 함께 준비 하는 단일 젤에 산 성 및 기본 단백질을 초점을 맞출 수 있는 안정적이 고 재현 가능한 산도 그라디언트의 형성을 활성화 합니다. 아크릴 아미드 분자에 부착 하 고 고정 된 산도 그라데이션을 형성 하는 겔에 캐스팅. 기온변화도를 고치는 것은 젤에 있는 편류를 방지하고 그들이 능률 적이고 및 재생 가능한 방법에서 던져질 수 있다는 것을 또한 보증합니다. 사용 하 여 좁은 산도 범위 더 큰 물리적 거리에 밖으로 확산 되었다 때문에 표준 2 차원 페이지와 함께 가능 했다 보다 단백질의 큰 숫자를 분리할 수 있습니다. 이 확산은 유사한 등전점(파이)값을 가진 단백질을 더 높은 해상도로 분리 할 수있게했습니다. 이 점을 설명하기 위해,호빙 등. 제 1 차원에서의 좁은 범위의 입체파 스트립을 적용하는 2 차원 페이지 방식 개발(11). 3.5 내지 10 의 산도 범위를 커버하는 6 개의 산도 스트립이 사용되었다. 림프종 세포주로부터의 단백질을 각 스트립에 도포하고 이를 이용하여 분리하였다. 각 스트립 다음 개별 페이지 젤 플레이트에 적용 하 고 그들의 분자량에 따라 두 번째 차원에서 단백질을 분리 했다. 약 5000 뚜렷한 관광 명소 3-10 의 산도 범위와 단일 표준 2 차원 페이지 젤 플레이트를 사용 하 여 감지 하는 1500 관광 명소와 비교 하는 6 개의 관광 명소 스트립을 사용 하 여 검출 되었다. 와일드 그루버 등. (12)3-5,5-6,및 5.5–6.7 의 산도 구배 범위 3-10 및 4-7 의 산도 구배 범위와 산도 스트립으로 실행 젤에 대 한 3 입도 스트립 스트립의 사용을 비교 했다. 그들은 2.3 과 1.6 을 각각 2 개의 넓은 구배 범위의 구배 스트립(3-10 및 4-7)보다 3 개의 좁은 범위의 구배 스트립 스트립을 사용하여 더 많은 단백질 반점을 검출 할 수있었습니다.

여러 개의 겹치는 좁은 입출력 장치를 사용하여 얻을 수 있는 더 높은 해상도는 더 많은 단백질을 식별할 수 있지만,각각의 좁은 스트립은 별도의 겔 플레이트와 동일한 샘플의 일정량을 각각 로드해야 합니다. 이 요구 사항은 샘플 부피 또는 농도가 제한된 경우 그러한 실험이 가능하지 않을 수 있음을 의미합니다. 제한된 샘플의 경우,더 넓은 산도 범위 또는 최소 개수의 입출력을 고려해야 합니다.

2 차원 미분 인 겔 전기 영동(2 차원-디제)

2 차원 페이지를 사용하여 단백질을 분리하는 목적은 두 가지입니다: (1)새로운 단백질 식별 및(2)비교 샘플 간의 상대적 풍부도 측정. 분리 기술로 2 차원 페이지의 장점 중 하나는 그것 뿐만 아니라 많은 단백질,해결 하지만 이러한 단백질을 염색 수 있습니다 단백질의 상대적인 풍부도 정량화. 예를 들어,두 개의 혈청 샘플(건강 및 질병)에서 추출한 단백질은 각각 별도의 젤 플레이트에 적재됩니다. 염색 후 단백질 반점을 정렬하고 스캔하여 개별 강도를 측정합니다. 소프트웨어 정렬 도구의 많은 발전이 이루어졌지만 두 개의 개별 젤 간의 직접적인 스팟-투-스팟 비교를 보장하는 것은 어려웠습니다. 1997 년에 2 차원 차동 젤 전기 이동 법(디제)의 개발 단일 2 차원 페이지 젤(13)내에서 분리 될 최대 3 개의 서로 다른 단백질 혼합물을 허용 하 여이 제한을 극복 했다. 일반적인 2 차원-디제 실험에서 단백질 3 개의 다른 샘플,건강,질병,및 내부 제어(건강 하 고 병에 걸린 샘플에서 추출 된 단백질의 동일한 금액을 혼합에서 형성 된 풀링된 샘플)에서 추출 된 공유 표시,각각 다른 여기 및 방출 파장을가지고 있는 시 아 닌 형광 염료. 표본은 일치된 이동입니다,그래서 염료의 무엇이든으로 레테르를 붙인 동일한 단백질은 겔에 동일한 위치에 이동할 것입니다. 사용 된 시아닌 염료는 다음과 같습니다: 1-(5-카르복시-펜틸)-1′-프로필인도카르바시아닌 할라이드 엔-하이드록시숙치니미딜 에스테르(사이 3);1-(5-카르복시펜틸)-1′-메틸인도디카-바시아닌 할라이드 엔-하이드록시숙치니미딜 에스테르(사이 5);및 3-(4-카르복시메틸)페닐 메틸-3′-에틸옥사카르바시아닌 할라이드 엔-하이드록시숙치니미딜 에스테르(사이 2). 다르게 표시 된 단백질 및 컨트롤 샘플의 동등한 농도 혼합,단일 젤 플레이트에 적용 하 고 2 페이지를 사용 하 여 분리. 제어 샘플은 내부 표준 역할을하여 겔 간 및 겔 내 일치를 모두 가능하게합니다. 대조 샘플은 실험의 모든 샘플에 존재하는 모든 단백질을 포함해야합니다. 이것은 실험의 모든 단백질이 내부 표준에서 고유 한 신호를 가지고 있음을 의미하며,이는 각 젤 내의 직접적인 정량적 비교와 젤 사이의 각 단백질에 대한 정량적 풍부 값을 정상화하는 데 사용됩니다. 형광 화상 카메라를 사용하여 각 염료의 특정 여기 파장에서 젤을 스캔하면 차동 표지 된 단백질을 시각화 할 수 있습니다(그림 1). 이미지는 병합 및 비교 될 단백질의 풍부 수준 사이의 차이를 가능하게 이미징 소프트웨어를 사용하여 분석된다. 이 값은 젤 오정렬과 관련된 오류를 제거하고 정확한 정량을 보장합니다(14).

관심 있는 단백질은 겔에서 절제되고,단백질 분해적으로 소화되고,여사를 사용하여 확인됩니다. 그것은 하나의 겔 플레이트를 사용하여 수행되기 때문에,2 차원-디제 그것을 더 경제적이고 쉽게 비교하고 더 정확하게 이미징 단백질의 두 개의 서로 다른 샘플 사이의 단백질 발현의 차이를 만드는 50%적은 젤을 필요로한다. 또한 디제에서의 라벨링 반응은 염색 방법을 사용한 시각화보다 빠르기 때문에 단백질 반점을 검출하는 데 더 적은 시간이 필요합니다. 두 개의 서로 다른 샘플의 단백질 발현 수준을 비교할 필요가있을 때,디제 선택의 방법이다(15).

2 차원 페이지의 강점과 약점

전기 이동 법은 해상도,검출,정량 및 재현성을 강화 하는 몇 가지 발전을 겪었다 설립된 기술 이다. 단백질 프로파일링에 대한 2 차원 및 2 차원 다이제 접근 방식은 높은 분해력을 보유하고 단일 겔 플레이트에서 수백 개의 단백질을 검출할 수 있는 접근 가능하고 경제적인 방법입니다. 재현성은 2 차원 페이지에 문제가 되었습니다,비록 특히 프로 파일링 두 단백질 혼합물,그것은 크게 향상 되었습니다 2 차원 디제 사용. 분석가가 산도 구배 범위가 좁은 초 줌 젤을 사용하여 최대 해상도에 맞게 산도 구배를 조정할 수 있도록 해 줍니다. 2 차원 페이지는 너무 염기성 또는 너무 산성,너무 크거나 너무 작은 단백질을 분해 할 수 없기 때문에 제한되었지만,이 제한은 지속적으로 감소하고 있습니다. 예를 들어,염기성 단백질의 분리는 4-12 의 산도 범위의 입자극기를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 분리 과학은 항상 진화하고 있으며,겔 전기 영동의 나머지 문제가 적절하게 해결되기까지는 오래 걸리지 않을 것입니다.

2 차원 다이제 도입 재현성 및 정량화 문제를 해결 하는 데 대단히 기여 했다. 이미 저 및 컴퓨터를 사용하면 빠른 데이터 마이닝,수집 및 분석뿐만 아니라 스팟 감지,정규화,단백질 프로파일 링,배경 보정 및 데이터보고 및 내보내기가 가능합니다. 분리,탐지 및 정량 기술,2 차원-디제 특히 단백질 식 수준 및 질병 바이오 마커 발견의 결정에 관련 된 임상 실험실에 대 한 중요 한 도구입니다. 샘플 사이의 절대 생물학적 변이가 주요 목표 인 경우,바이오 마커 발견에서와 같이,2 차원 디제 선택의 방법이다.

논겔(또는 솔루션 기반)분석 온라인 직접 분별 방법을 결합 하는 방법에 상당한 진전이 있다,하는 동안 2 차원 페이지 프로테옴 연구를 수행 하기 위한 인기 있는 기술을 유지 하고있다. 2 차원 페이지는 어떤 분류 체계와 마찬가지로 장점과 단점을 가지고 있지만,앞으로 수년 동안 프로테옴의 특성화에 필수적인 기술로 남을 것이라는 데는 의심의 여지가 없습니다.