소개
조직,세포 및 세포 내부의 작은 구조(세포 소기관)는 대부분 물이므로 투명합니다. 많은 정보를 포함하지 않는 이미지에 물 결과의 작은 시스루 가방을 이미징,현미경,그것은 샘플 색상의 영역을 제공하고 볼 훨씬 쉽게 만들 것입니다 대비 또는 얼룩의 일종을 가지고하는 것이 중요합니다. 또한,당신은 단지 이미지 핵 또는 세포막과 같은 세포 내부의 작은 구조의 일부를하려는 경우? 전체 셀을 색칠하면 관심있는 영역을 지역화하는 것이 불가능합니다.
형광 대조 및 현지화의 두 가지 문제를 해결합니다. 형광은 물체가 빛을 흡수 한 후 빛을 방출하는 곳입니다. 많은 다른 개체 전시 형광,미네랄(미네랄 형 석에서 오는 형광 단어),심해 물고기(가장 유명한 해파리 빅토리아,녹색 형광 단백질(녹색 형광 단백질)발견),식물,화학 물질 및 더 많은.
형광 분자(플루오로 포어라고도 함)는 샘플에 라벨을 붙이는 데 사용되며 거의 모든 색상의 빛을 방출하는 형광 포어를 사용할 수 있습니다. 형광 현미경에서 샘플에 형광 단자가 표시된 다음 밝은 빛(여기 빛)을 사용하여 샘플을 조명하여 형광(방출 빛)을 방출합니다. 이러한 방식으로,샘플은 형광 단자가 밝은 색의 빛을 방출함에 따라 검정색 배경에 매우 대조됩니다. 관심 영역에 이러한 형광 단자를 지역화함으로써 세포의 어떤 부분의 명확한 이미지를 촬영 할 수 있습니다,형광 현미경 생명 과학을위한 강력한 도구 만들기.
밝은 필드 대 형광 이미징
밝은 필드 현미경 검사에서 샘플은 전송 된 백색광으로 조명됩니다. 이것은 현미경의 밑에 견본의 고도 높게 대조하거나,얼룩이 지거나 자연적으로 색칠한 견본을 관찰하기 위하여 조명을 창조합니다. 그러나 밝은 필드는 관심있는 과정을 연구하기 위해 투명/반투명,염색되지 않은 세포 또는 세포 구조를 구별하기에 충분하지 않습니다.
형광 현미경은 다른 파장의 빛에 노출되었을 때 특정 가시 파장의 빛을 방출하는 형광 단자의 사용에 의존합니다. 이러한 플루오로 포어가 표적 관심 구조에 결합 될 때,플루오로 포어에서 방출 된 광자를 사용하여 이러한 관심 구조를 시각화 할 수 있습니다. 형광 현미경의 이점은 표적으로 한 구조가 표적으로 한 지역의 형광에 약간이 있는 동안 조명되어,쉬운 표적으로 하고 화상 진찰을 허용한ㄴ다는 것을 이다.
분자가 형광을 발하는 이유
형광의 기원은 전자가 활성 형광을 중심으로 자유롭게 이동하여 흡수 된 에너지를 방출하는 것이다.2.
여기 전에 전자는 사용할 수있는 가장 낮은 에너지 상태,즉 접지 상태에 있습니다. 전자가 특정 에너지 범위의 광자에 부딪 힐 때,전자는 광자의 에너지를 흡수하고 더 높은 에너지 상태(에스 1,에스 2,또는 에스 3)로 점프합니다. 지상 상태로 돌아 가기(에스 0),전자는 광자의 방출로 추가 에너지를 방출. 이 광자의 에너지는 여기 에너지보다 적기 때문에 파장이 더 길다. 이런 이유로 방출 빛에는 여기 빛 보다는 더 긴 파장이 있고 다른 색깔로 나타날 수 있습니다.
방출된 광양자는 가시 스펙트럼에 보통 있고 현미경의 밑에 충분히 흥분한 형광성이 있는 경우에 전망될 수 있습니다. 방출 된 광자의 파장은 모든 형광 단자에 대해 특이 적이며이 예측 가능성은 쉽게 형광 이미징을 가능하게합니다.
형광 강도 인자
형광 포어는 예측 가능한 파장의 형광을 방출 할 수 있지만 형광 강도를 제어하는 요인을 아는 것도 중요합니다. 빛의 강렬한 충분한 방출 없이,형광은 현미경에 탐지가능하지 않을 것입니다.
양자 수율
플루오로 포어의 양자 수율(2950)은 방출 된 광자 수와 흡수 된 광자 수의 비율입니다. 양자 수율은 종종 0-1 의 값으로 표현되며,1 은 광자 변환의 100%효율입니다. 또한 각 형광 포어는 최적의 형광 효율을 위해 고유 한 산도,이온 강도 및 온도를 가지고 있습니다.
소멸 계수
모든 형광체는 광자를 여기시키기 위해 적절한 파장 범위 내에 있더라도 광자를 흡수하는 능력이 다릅니다. 형광 포어가 여기 파장과 적절하게 일치하는 광자에 노출되면 광자가 흡수 될 확률은 측정 가능한 특성이며 소멸 계수(100%)로 알려져 있습니다.
플루오로 포어의 양자 수율 및 소멸 계수는 종종 형광 포어가 실험 환경에서 얼마나 밝은 지 설명하기 위해 함께 표시됩니다.
형광 수명
형광 단자 전자가 광자를 흡수하면 더 긴 파장 광자를 즉시 방출하지 않습니다. 흥분된 에너지 상태 사이의 일부 에너지 방출은 서로 다른 시간이 걸리는 것으로 알려져 있습니다. 전자가 광자를 방출하고 접지 상태로 돌아 가기 전에 여기 상태에서 보내는 시간은 형광 수명을 측정 한 것입니다. 모든 플루오로 포어의 수명은 고유하며 실험적으로 측정 할 수 있습니다. 형광성 염료를 실험적으로 사용할 때,칼슘 화상 진찰 뉴런과 같은 고속을 요구하는 신청을 위한 그들의 일생에 특히 도움이 됩니다.
여기 파장 강도
대부분의 형광 현미경 설정은 원하는 파장 범위를 출력하도록 조정할 수 있는 광원을 포함합니다. 많은 형광 광원은 또한 광 경로를 통해 이동하는 광자의 수를 증가시키기 위해 여기 강도에 맞게 조정될 수 있습니다. 여기 파장에 노출 된 형광 표지 샘플에서 모든 형광 단자는 동시에 활성화되지 않습니다. 여기 강도를 증가시키고 샘플에 도달하는 광자의 수를 증가시킴으로써,더 많은 플루오로 포어가 여기 될 확률이 더 높다.
광 저항성
광 저항성은 분자 또는 유기체가 손상에 저항하는 능력입니다. 형광 현미경에서 형광 포어는 결국 다가오는 광자 흡수를 멈추고 영구적 인 어두운 상태로 들어갑니다. 유기체가 어두운 상태에서 더 많은 플루오로 포어를 수집함에 따라 표지 된 표적의 모양이 줄어들고 샘플은 광표백이라고합니다. 형광 현미경 검사 법에서 단계는 종종 실험 하는 동안 경험 하는 광 표 백의 양을 줄이기 위해 촬영 됩니다. 몇몇 측정은 견본과 상호 작용하는 빛의 강렬에 있는 감소 및 다른 염료만큼을 위해 액티브하게 남아 있지 않는 전문화한 형광성 염료의 사용을 포함합니다.
형광 현미경
연구자들에게 형광의 주요 이점은 형광 현미경을 사용할 수있는 능력이며,여기서 샘플은 염료,항체 또는 단백질과 같은 형광 물질로 표지/염색되어 이미지가 대비를 가질 수 있습니다. 이러한 형광 라벨을 대상으로,연구자들은보고 싶은 것을 선택할 수 있습니다. 이 그림.그들은 형광 마커의 다른 색상으로 표시되어 있습니다로 신경 세포가 명확하게 성상 세포 사이에서 볼 수 있습니다 3.
일반적으로 형광 현미경의 경우 샘플은 형광 마커(일반적으로 샘플의 특정 부분에 대해 특정)로 레이블이 지정됩니다. 그런 다음 샘플을 형광 단자에 대한 특정 여기 파장으로 조명하고 결과 방출 형광은 검출기(일반적으로 민감한 과학 카메라)에 의해 수신됩니다.
대부분의 형광 현미경은 여기 및 방출이 동일한 광 경로를 통해 수행되는 형광 현미경입니다. 여기 조명과 방출 된 형광 모두 현미경 목표를 통과하며 일반적으로 형광을 감지하기 위해 필터링됩니다. 이 설정은 그림 1 에 나와 있습니다.4.
자가 형광
일부 구조,생물학적 유기체 및 일반 현미경 샘플은 자연적으로자가 형광으로 알려진 형광을 나타낼 수 있습니다. 이것은 표지 된 샘플의 형광과는 다르지만 종종 유사한 파장을 공유하므로 자기 형광 현미경 샘플은 인위적으로 추가 된 형광을 가리고 탐지를 방해하여 신호를 줄일 수 있습니다. 특정 파장을 피하기 위해 사용하지 않는 한,이 작업은 형광 이미징에 영향을 미치므로 샘플이자가 형광을 나타내는 지 아는 것이 중요합니다.
자가 형광 개체의 일반적인 예는 미토콘드리아,리소좀,콜라겐 및 트립토판,티로신 및 페닐알라닌과 같은 일부 아미노산입니다. 특히,자가 형광은 엽록소 및 리그닌 및 카로틴과 같은 다른 형광 분자의 사용으로 인해 식물에서 일반적입니다. 그림.도 5 는 레이블이없는 스코틀랜드 소나무 샘플로부터의자가 형광의 다른 색상을 보여줍니다.
요약
최초의 형광 염료가 도입된 이후,형광 현미경은 기존의 밝은 현미경 기술보다 높은 특이성을 가진 세포 및 세포 구조를 시각화하는 데 크게 활용된 도구였다. 연구진은 관련 데이터를 얻기 위해 관심 영향 형광 실험의 구조,광학 특성 및 프로브를 관리 할 수 있습니다. 이러한 유연성으로 인해 형광 현미경이 많은 생명 과학 실험에 포함될 수 있습니다.
시료 및 형광체의 종류에 따라 최상의 이미징 결과를 얻기 위해 과학 카메라를 신중하게 선택해야합니다.
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