en regelbasert modell for insulinsignalbane

modellen for insulinsignalbane

fra tre publiserte modeller implementerte VI MODELLEN FOR ISP som vist i Fig. 1 bruke Systembiologi Grafisk Notasjon .

modellen av insulin signalveien. Modellen Av Insulin Signalvei oppnådd ved å integrere PI3K-AKT-banen, mTOR-banen og RAS-MAPK-banen, avbildet ved Hjelp Av Systems Biology Grafisk Notasjon. Fargede noder ligne clustering resultater oppnådd på simulerte profiler (Se Fig. 3 ). Fargede linjer representerer viktige tilbakekoblingsmekanismer; nemlig: den røde linjen representerer p70s6k-IRS1 negativ feedback loop, den blå linjen ERK1 / 2-GRB2 / SOS negativ feedback loop

modellen består av mange av de essensielle elementene som er ansvarlige for insulinvirkningen, siden DE tre hovedunderbanene TIL ISP, kort beskrevet i det følgende, er inkludert.

PI3K-AKT-banen

FOR PI3K-Akt-banen refererer vi mest til modellen I Sedaghat et al. . Modellen har blitt brukt av flere forskningsgrupper og inneholder mange av de mest kjente signalkomponentene som formidler translokasjonen av glukosetransportør GLUT4. Disse inkluderer insulinreseptorbinding og resirkulering av delsystemer; postreseptorsignaleringsundersystemet inkludert Både Ser – og Tyr – fosforylering ved insulinreseptorsubstratet1 (IRS1); dannelsen av et kompleks (IRS1_PI3K-kompleks) mellom fosforylert IRS1 og fosfatidylinositid 3-kinase (PI3K); fosfatidylinositol 3,4,5-trisfosfater PI(3,4,5)P3, syntese; fosforyleringen av proteinkinase B (AKT) og proteinkinase C(PKC) – ζ; translokasjonen AV GLUT4 til plasmamembranen. Protein tyrosin fosfatase (PTP1B) og lipid fosfataser (SHIP2 OG PTEN) effekter er også vurdert i modellen.

TSC1/2-mTOR-banen

FOR TSC1 / 2-mTOR-banen refererer vi mest til modellen som nylig ble publisert i Sonntag et al. , beskriver mtor-effekten som respons på insulin og aminosyrer. Modellen vurderer både mtor-komplekser: mTORC1 og mTORC2. mTORC1-aktivering er avhengig av tilstedeværelsen av aminosyrer og hemmes av Tuberøs sklerose protein 1 og 2 (TSC1/2) aktivering (Dvs.Ser fosforylering), som igjen avhenger av 5′ AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) aktivering. AMPK-aktivering avhenger AV irs1 Tyr-fosforylering, MENS TSC1 / 2-hemming (dvs. Tyr-fosforylering) avhenger AV akt-fosforylering Ved Thr309. mTORC2, som nylig ble identifisert som den ukjente fosfoinositidavhengige proteinkinasen 2 (PDK2), dvs. kinasen som er ansvarlig For ser474 fosforylering AV AKT, bidrar til dobbelt fosforylering av AKT sammen Med Thr309 fosforylering, operert av fosfoinositidavhengig proteinkinase 1 (PDK1). Sonntag et al. formuler hypotesen om tilstedeværelsen AV EN PI3K-variant, som er direkte regulert av den aktiverte insulinreseptoren, og aktiverer i sin tur mTORC2. Vi inkluderte denne hypotesen i vår modell.

RAS-MAPK-banen

FOR RAS-MAPK-banen refererer vi mest til modellen I Borisov et al. , beskriver BÅDE EGF og insulinstimuleringer. Modellen inneholder alle de viktigste kjemiske mekanismene som er involvert i ras-MAPK-banen: samspillet Mellom Tyr-fosforylert IRS1 og SHP2 (den sh2-domeneholdige tyrosinproteinkinase 2) og GRB2-SOS-komplekset (vekstfaktorreseptor – bundet 2 og sønnen av syvløs kompleks), og danner dermed henholdsvis shp2-IRS1 og GRB2/SOS-IRS1-kompleksene; GTP-bindingen AV RAS; fosforyleringen AV RAF proto-onkogen serin/treonin-proteinkinase (c-raf); interaksjonen av insulinreseptor med ras GTPase aktiverende protein (RASGAP), som igjen katalyserer den omvendte prosessen Med ras deaktivering; aktiveringen av proto-onkogen tyrosin-proteinkinase SRC som fullt aktiverer C-RAF; den doble spesifisiteten mitogenaktivert kinase 1/2 (MEK1/2); de ekstracellulære signalregulerte kinasene (ERK1/2).

Integrering AV PI3K-AKT, TSC1/2-MTOR og RAS-MAPK banene

pi3k-AKT, TSC1/2-mTOR og RAS-MAPK banene inneholder flere overlappende deler, som i de opprinnelige papirene ofte ble modellert på forskjellige måter basert på litt forskjellige forutsetninger. Vi sammenlignet de overlappende reaksjonene på tvers av ulike modeller og implementerte den mest oppdaterte versjonen av dem basert på dagens kunnskap om cellulær biokjemi. Videre krevde integrasjonen av de tre modellene å håndtere de forskjellige måleenhetene som ble vedtatt for å beskrive tilstandsvariablene. Mens immunoblot eksperimenter tillate å få viktig informasjon om tidsskalaen av signalhendelser, kvantitativ informasjon om protein uttrykk er ofte problematisk å hente slik at de forventede konsentrasjon profiler er noen ganger rapportert i mikromolar konsentrasjon, som I Borisov et al. , eller i vilkårlig enheter (AU), som I Sonntag et al. . I motsetning, I Sedaghat et al. konsentrasjonen ble uttrykt enten i molare enheter eller i prosent av total konsentrasjon (F. eks. GLUT4 cytosolkonsentrasjon ble ansett å være 96 % av DEN totale GLUT4-konsentrasjonen i cellen ved baseline tilstand).

Potensielt tillater RBM å utføre både deterministiske og stokastiske simuleringer, forutsatt at variabelmengder uttrykkes i kopier av molekyler per celle. Selv om vi i det nåværende arbeidet ikke brukte stokastisk simulering, justerte vi alle variablene til samme enhet, dvs. antall molekyler per celler, ved å multiplisere molare enheter MED NA * V (NA indikerer Avogadro nummer Og v cellevolum, anses lik 3e – 12 l). Alle detaljer om enhetskonvertering FRA AU og prosentkonsentrasjoner er gitt I Materiale og Metoder.

den resulterende modellen består av 42 reaksjonsregler og 101 parametere som koder for samspillet mellom 61 forskjellige kjemiske arter. Reaksjoner, parameterverdier og innledende forhold er alle rapportert i Tilleggsfilen 1.

Novelties AV rbm-ISP modell

rbm implementering, tilrettelagt regnskap for en rekke AV ISP funksjoner, slik som fosforylering av signalproteiner på flere steder og med flere effekter, samtidig interaksjon av molekyler med forskjellige bindingspartnere og subcellulær lokalisering av noen reaksjoner. Ovennevnte egenskaper er omtalt i detaljer i det følgende.

Fosforylering av signalproteiner på flere steder

Signalmolekyler kan ha forskjellige aktivitetsnivåer, avhengig av hvilke rester som fosforyleres. TA FOR EKSEMPEL IRS1 og AKT. IRS1 har mange rester potensielt involvert i post-translasjonelle modifikasjoner og kan aktiveres eller hemmes i sin kinase handling, avhengig av fosforylerte rester blir Tyr Eller Ser . For eksempel er tyr-896 fosforylering nødvendig FOR PI3K, SHP2 og GRB2-binding, mens Ser-636 fosforylering ved p70S6K er en mekanisme relatert til insulinresistens . AKT, derimot, kan aktiveres ved fosforylering Ved Thr309 Eller Ser474 VED HENHOLDSVIS PDK1 og mTORC2 .

IRS1 fosforyleringsavhengig aktivering / hemming var allerede inkludert I Sedeghat-modellen, selv om Ser fosforylering ble regulert av PKC og ikke av p70S6K, som I sonntag-modellen. Her modellerte VI både pkc og p70S6K handlinger og beskrev pIRS1-Tyr896 kompleks formasjon / dissosiasjon MED PI3K, SHP2 og GRB2 .

de to fosforyleringsstedene TIL AKT ble ikke eksplisitt modellert I Sedaghat et al. . Vi modellerte akt fosforylering Ved Thr mediert AV PI (3,4,5) P3 som I Sedaghat et al. modell og AKT fosforylering Ved Ser formidlet av mTORC2 som I Sonntag et al. modell og antatt:

1. i)

   akt fosforylert enten Ved Thr eller begge steder for å virke PÅ TSC1 / 2-kompleks ved å formidle fosforylering Ved Tyr og defosforylering Ved Ser ;

2. ii)

   akt fosforylering på Ser eller begge steder for å inaktivere C-RAF ;

3. iii)

   akt fosforylering ved Enten Thr eller Ser for å aktivere GLUT4 translokasjon .

Interaksjon med flere bindingspartnere

samspillet mellom molekylene i signalveiene med mange forskjellige bindingspartnere resulterer i potensiell dannelse av forskjellige komplekser. I ISP, IRS1 fosforylert På Tyr-896 kan binde PI3K som modellert I Sedaghat et al. ELLER GRB2 / SOS og SHP2, som modellert I Borisov et al. . For å matche RBM-ISP – modellspesifikasjonen med dagens kunnskap, tillot vi dannelsen av forskjellige komplekser. DERMED KAN IRS1 binde PÅ en gjensidig eksklusiv måte GRB2/SOS OG SHP2, men kan binde SAMTIDIG GRB2 / SOS OG p85 regulatorisk underenhet AV PI3K .

Informasjon om subcellulær lokalisering i reaksjonsregler

muligheten for at proteiner må interagere er ofte relatert til deres fysiske lokalisering, dvs. deres tilstedeværelse i det ekstra cellulære rommet, cytoplasma, kjerne, plasmamembran, etc. For eksempel fungerer lipider PI (3,4,5) P3 som dokkingssteder for plasmamembraner som rekrutterer forskjellige proteiner som inneholder pleckstrin homologi (PH) domener (f. eks. AKT og PDK1) og deres co-lokalisering kan akselerere spesifikke signalhendelser . Et annet eksempel er samspillet mellom mTORC1 og ras-homologen beriket i hjernen (RHEB) og Rag-familien på lysosommembran, rapportert Av Zoncu et al. . I vår modell inkluderte vi informasjonen om subcellulær lokalisering for insulinreseptoren og GLUT4-transportøren, som skiller mellom deres plasmatiske og cytoplasmatiske lokalisering i henhold til den matematiske beskrivelsen gitt Av Sedaghat et al. .

modellspådommer

konsentrasjonsprofilene til alle kjemiske arter som populerte modellen ble simulert ved 60 min, 100 nM insulinstimulering. Konsentrasjonen på 100 nM representerer et godt akseptert nivå av insulinstimulering i cellekulturer som ofte finnes i litteraturen og brukes også av vår gruppe . Ifølge Sonntag et al. , antok vi også en konstant aminosyrestimulering, som er nødvendig for å oppnå mtorc1-aktiveringen og tilbakemeldingen av p70S6K PÅ IRS1. For å vurdere modellens pålitelighet ble modellspådommer sammenlignet med eksperimentelle data tilgjengelig i datasettet for noen fosfoproteiner ved tid 2, 5, 10, 30 og 60 min etter insulin pluss aminosyrer, dvs .leucin, stimulering. Som vist I Fig. 2, de eksperimentelle og spådde profilene til pAKT-S473 og pmTORC1-S2448 er i god avtale, siden de begge viser et økende fosforyleringsmønster som når en stabil tilstand i henholdsvis de første 2-5 min og 20-30 min. Den forutsagte profilen for ppERK1 / 2-Y202, Y204 er bekreftet av eksperimentelle data i de første 10 minuttene, mens det i de siste tidspunktene reduseres raskt i eksperimentelle data med hensyn til modellforutsigelser. Profilen observert i eksperimentelle data for ppERK1 / 2-Y202, Y204, kan bli nærmere matchet ved å øke styrken av tilbakemeldingen mellom ppERK1 / 2-Y202, Y204 og GRB2/SOS. I Fig. 2 (øvre høyre panel, prikket linje), den simulerte profilen til ppERK1/2-Y202,Y204 oppnådd ved å multiplisere parameteren kcat39 (se Tilleggsfil 1) med en faktor på 10 vises. Vi bruker verdien fra litteraturen, utsetter parameteroptimalisering for fremtidige studier, når ytterligere data vil være tilgjengelige. Dessverre var eksperimentelle data for pP70S6K-T389 ikke pålitelige (bare en replikat tilgjengelig), så vi kan ikke sammenligne eksperimentelle og simulerte profiler for dette proteinet, som er et endepunkt for banen med en viktig tilbakemeldingshandling PÅ IRS1. Likevel er den simulerte profilen vist I Fig. 2 (nedre, høyre panel) ligner eksperimentelle data vist i andre papirer .

Sammenligning mellom simulerte og eksperimentelle data. Sammenligning mellom eksperimentell konsentrasjon (poeng) og normaliserte modellspådommer (linjer) for pAkt-S473, ppERK1/2, pmTOR-s2448 og pP70S6K-T389. Profilen til ppERK1 / 2-Y202, Y204 oppnådd ved å øke styrken av tilbakemeldingen mellom ERK og GRB2/SOS er vist i stiplede linjer. Verdier er rapportert for eksperimentelle data av humane skjelettmuskelceller (SkMCs) eksponert FOR EBSS + 100 nM insulin ved tiden 0′, 2′, 5′, 10′, 30′, og 60′. Alle målinger ble tatt i tre biologiske replikerte, og for hver biologiske replikater ble det tatt tre tekniske replikerte målinger. Alle data er uttrykt i vilkårlige enheter (AU) og rescaled mellom 0 og 1 for sammenligningens skyld

Vi undersøkte de forutsagte profilene til alle de aktive artene og grupperte dem i fire klynger i henhold til deres dynamiske oppførsel, som vist I Fig. 3:

Gruppering av simulerte profiler. Fire klynger ble identifisert for de forventede profilene til de aktive artene, i henhold til deres dynamiske oppførsel: 1) Rask respons når steady state innen 2-5 min (blå); 2) Rask overshooting svar når en topp innen 2-5 min og synkende til en steady state etter 10-20 min (grønn); 3) Langsom respons når steady state i 10-20 min (oransje); 4) Slow overshooting svar når en topp i 5-10 min og synkende til en steady state i 30-60 min (lilla)

1. Rask respons, når steady state innen 2-5 min (blå)

2. Rask overshooting respons, når toppen innen 2-5 min og deretter steady state etter 10-20 min (grønn)

3. Langsom respons, når steady state i 10-20 min (oransje)

4. Slow overshooting responses, når toppen i 5-10 min og steady state i 30-60 min (lilla).

etter insulinstimulering reagerer insulinreseptoren raskt ved å fosforylere og utløse en kaskade av hendelser langs forskjellige veier. LANGS PI3K-AKT-banen er alle mekanismer tett relatert TIL IRS1 Tyr – fosforylering preget av en rask respons. Det samme gjelder for andre direkte mål FOR IRS1 fosforylert Ved Tyr langs TSC1 / 2-MTOR kaskade, dvs.AMPK fosforylering ved T172, SHP2-IRS1 og GRB2/SOS-IRS1 komplekser dannelse. Den raske responsen er preget av enten en rask økning til steady state eller ved en forbigående overskridelse etterfulgt av steady state-tilstanden, avhengig av fravær / tilstedeværelse av tilbakekoblingsmekanismer som virker på målmolekylet (sak 1 og 2, i henholdsvis blå og grønn, I Fig. 3). Mekanismer som hovedsakelig utgjør TSC1 / 2-mTOR-banen og spiller en rolle I ser-fosforylering AV IRS1 er preget av en relativt langsom ikke-overskytende respons (sak 3, oransje I Fig. 3). Som observert ovenfor antar ras-MAPK-banen i sine oppstrømskomponenter en rask respons ,som blir merkbart langsommere for de nedstrøms (sak 4, lilla I Fig. 3).

generelt er molekyler nedstrøms banen, relatert til relativt langsomme prosesser som transkripsjonsaktivering eller interaksjon med miljøet utenfor cellen, som ERK1/2 og GLUT4, preget av langsom respons, mens molekyler oppstrøms banen er preget av en rask respons for å fremkalle en rask signalutbredelse. I denne sammenheng kan overskytingsresponsen etterfulgt av retur til steady state bidra til å oppnå en rask signalutbredelse på en signalrute, noe som gjør molekyler igjen tilgjengelige for andre signalruter umiddelbart etter.

modell spådommer i fravær av kontrollmekanismer

en rekke simuleringer ble deretter utført for å undersøke robustheten av systemet på TO mål effekter AV ISP: GLUT4 translokasjon og ERK1 / 2 fosforylering. Spesielt ble rollen til to store kontrollmekanismer for å regulere måleffektene analysert:

• P70S6K-IRS1 negativ feedback loop (rød linje I Fig. 1);

• ERK1 / 2-GRB2 / sos negativ feedback loop (blå linje I Fig. 1);

TIL dette formål ble tidsforløpet FOR GLUT4-og ERK1/2-respons i nærvær og fravær av de to reguleringsmekanismer som er nevnt ovenfor, sammenlignet (Fig. 4). Dynamikken til dobbelt fosforylert ERK1 / 2 påvirkes sterkt av BÅDE P70S6K-IRS1 og ERK1/2-GRB2/SOS negative tilbakemeldingsløkker. På den annen side påvirkes ikke steady state og dynamisk oppførsel AV GLUT4 i membran AV ERK1/2, men er sterkt påvirket AV p70s6k-IRS1 negativ tilbakemeldingsløkke, og bekrefter dermed den bemerkelsesverdige betydningen av denne sistnevnte kontrollmekanismen for å bestemme systemdynamikken.

Simulerte pperk1 / 2-T202-Y204 (øvre panel) og GLUT4 membrankonsentrasjon (nedre panel) profiler ved 100 nM insulinstimulering, med den komplette modellen (svart), modellen uten p70S6K-IRS1 tilbakemelding (rød) og modellen uten ERK1/2-GS tilbakemelding (blå). Denne sistnevnte påvirker IKKE GLUT4 membrankonsentrasjon; DERFOR GLUT4 simulerte profiler med OG uten ERK1 / 2-GS tilbakemelding er superimposable

det er velkjent at insulinresistens er assosiert med defekter I IRS-avhengig signalering, noe som impliserer dens dysregulering i initiering og progresjon av metabolsk sykdom. En fremvoksende oppfatning er at den positive / negative reguleringen AV IRS ved autologe veier er gravd i sykdom ved økte basale og andre temporært upassende serin / treoninfosforyleringer, noe som fører til redusert glukoseopptak. Kompenserende hyperinsulinemi kan stige på dette punktet og føre til slutt til diabetes. SELV OM IRS1 (OG IRS2) er regulert gjennom en kompleks mekanisme som involverer fosforylering av mer enn 50 forskjellige serin / treoninrester, synes DET i VÅR modell p70s6k-IRS1 negativ tilbakemeldingssløyfe avgjørende for en god kontroll av glukoseopptaket. Forbedring AV p70s6k-IRS1 negativ tilbakemeldingssløyfe er i stand til å forklare redusert insulinfølsomhet og glukoseopptak (Fig. 5). Tilsvarende (selv om de også hypoteser en positiv tilbakemelding fra mTOR til en annen IRS1 Serinrest), Brä Et al. ved å bruke en minimal modell av insulinsignalering, viser at en redusert positiv tilbakekoblingsmekanisme er i stand til å forklare et redusert glukoseopptak.

Simulert GLUT4 membrankonsentrasjon ved 60 min ved forskjellig insulinstimulering, med den komplette modellen (svart), modellen uten p70s6k-IRS1 tilbakemelding (rød) og modellen med forbedret p70s6k-IRS1 tilbakemelding, oppnådd ved å øke parameteren k15 med 100% av vaue (grønn)

på den annen side virker både p70s6k-IRS1 og ERK1/2-GRB2/SOS negative tilbakemeldingsløkker avgjørende for å garantere at dobbelt fosforylert ERK viser en forbigående oppførsel, med en topp på 10 min etterfulgt av en retur til baseline tilstand. Denne atferden er allerede rapportert i litteraturen under insulin stimulus og under epidermal vekstfaktor stimulus . En forbigående ERK-respons forhindrer en vedvarende aktivering av ERK som vil resultere i kontinuerlig celleproliferasjon .

Sensitivitetsanalyse

for ytterligere å undersøke rollen til de to store kontrollmekanismene ved regulering av måleffektene, ble lokal sensitivitetsanalyse utført ved å anvende en liten forstyrrelse (0.1% av parameterverdien) til en modellparameter om gangen og evaluering av de resulterende relative endringene AV GLUT4-translokasjon og ERK1 / 2 fosforylering (Se Metoder). Tabell 1 og 2 viser følsomhetskoeffisientene til modellparametrene, rangert i henhold til deres absolutte verdi og sammenlignet med verdien koeffisientene antar ved fjerning AV p70s6k-IRS1 og ERK1/2-GRB2/SOS negative tilbakemeldingsløkker. Disse koeffisientene måler den samlede effekten, dvs. under observasjonsvinduet, av en parameterendring på utfallet, dvs. GLUT4 og ERK respons. Positive / negative verdier betyr at økning av parameterverdien har effekten av å øke / redusere responsen. Siden små absolutte verdier betyr at parameterendringene ikke signifikant påvirker utfallet, rapporteres kun koeffisient større enn 0,1 % (absolutt verdi), enten i den opprinnelige eller modifiserte modellen, i Tabell 1 og 2.

Parametrisk sensitivitetsanalyse av den komplette MODELLEN for GLUT4-respons viser at de mest sensitive parametrene er relatert TIL GLUT4-translokasjon til plasmamembran, etterfulgt av de som er relatert til lipiddannelse OG IRS1_PI3K kompleks dannelse/dissosiasjon. Fraværet av p70S6K_IRS1 tilbakemelding har en sterk innvirkning på å øke følsomheten (absolutt verdi) av parametere relatert til lipiddannelse OG IRS1_PI3K kompleks formasjon/dissosiasjon.

Parametere relatert TIL baseline IRS1 fosforylering / defosforylering Ved Tyr / Ser, har lavere følsomhet, noe som reduserer (absolutt verdi) generelt ved å fjerne p70s6k-IRS1 tilbakemelding, med unntak av parameter k7p, relatert TIL IRS1 fosforylering ved Ser. Parametre relatert TIL PKC-mediert IRS1-fosforylering ved Ser viser også økte verdier etter fjerning AV p70s6k-IRS1-tilbakemelding. SIDEN ERK1 / 2-GRB2 / SOS feedback fjerning ikke har noen effekt PÅ GLUT4 translokasjon, endres følsomhetskoeffisientene ikke med og uten denne tilbakemeldingen.

Parametrisk sensitivitetsanalyse av den komplette modellen FOR ERK1/2-respons viser at de mest sensitive parametrene er relatert TIL ras -, MEK-og RAF-aktivering og TIL IRS1-fosforylering ved Tyr og Ser, sistnevnte mediert av p70S6K. Langs BÅDE PI3K-AKT og ras-ERK1/2-banen, SYNES ERK1/2-GRB2/SOS-tilbakemelding å ha en viktig rolle på systemets robusthet. Systemdynamikken påvirkes svakt av fraværet (Se Fig. 4), mens parameterfølsomheten øker (i absolutt verdi) i nesten alle tilfeller hvis denne tilbakemeldingen fjernes.

Konklusjoner om effekten AV p70s6k-IRS1 tilbakemelding på ERK1 / 2 respons er mer kontroversielle. Fjerning av denne tilbakemeldingen har effekten av å redusere parameterfølsomheten langs PI3K_AKT-banen, mens den langs RAS-ERK1 / 2-banen nesten ikke har noen effekt for parametere relatert TIL mek-fosforylering, RAF-inaktivering og erk-fosforylering. Det reduserer følsomheten for parametere relatert TIL RAS, RAF-aktivering OG IRS1-GRB2 / SOS og IRS1-SHP2 komplekse forstyrrelser. Det øker sterkt følsomheten til parametere relatert TIL SRC og RAF-aktivering.

disse resultatene fremhever den sentrale rollen som negative tilbakemeldingsløkker i å bestemme ikke bare dynamikken i et biologisk system, men også dets robusthet. Denne egenskapen er av bemerkelsesverdig betydning fordi den bevarer systemets dynamiske oppførsel mot støy og små biologiske svingninger som ofte skyldes intercellulær variabilitet.