Todimensjonal polyakrylamidgelelektroforese (2D-SIDE): fremskritt og perspektiver

Introduksjon

de siste 25 årene, og spesielt det siste tiåret, har vært vitne til økt innsats for å utvikle teknologier som er i stand til å identifisere og kvantifisere et stort antall proteiner uttrykt i et cellesystem (dvs.proteomet) i håp om å oppdage sykdomsbiomarkører, kartlegge proteinkretser eller identifisere nye fosforyleringssteder, for eksempel. Kompleksiteten til proteomet har gjort utvikling av metoder for effektiv separasjon og sensitiv deteksjon av proteiner en kritisk komponent i denne innsatsen. Fortsatt fremskritt innen MASSESPEKTROMETRI (MS) teknologi har muliggjort deteksjon av proteiner med mye større hastighet og følsomhet enn tidligere mulig. SELV banebrytende MS er imidlertid ikke i stand til å karakterisere alle komponentene i et komplekst proteom. Forskere tar en» splitt og hersk » tilnærming til å karakterisere proteomer, ved at de forsøker å midlertidig begrense antall proteiner som massespektrometeret blir bedt om å analysere. Ved å spre ut proteomet, vil flere proteiner til slutt bli analysert i et individuelt eksperiment.

for å skille proteomer har forskere brukt elektroforetiske og kromatografiske teknologier, separat og i kombinasjon, og både offline og online. Selv om disse anstrengelsene kan resultere i separasjon og identifisering av tusenvis av proteiner, kan ingen enkelt metode løse alle proteinene i et proteom, på grunn av deres store antall og konsentrasjonsdynamiske område. Enkeltdimensjonsseparasjoner er utilstrekkelige for effektivt å løse komplekse proteinblandinger. Dette faktum ble anerkjent over et halvt århundre siden Av Smithies Og Poulik (1), som anerkjente at en kombinasjon av to elektroforetiske prosesser på en gel i rette vinkler skulle gi en mye større grad av oppløsning enn det som er mulig med enten separat. De to elektroforetiske prosessene er oppløsning av molekylær størrelse og fri løsningsmobilitet på en stivelsesgel. Deres prediksjon fortsetter å være bevist sant og har dannet grunnlaget for å utvikle ortogonale flerdimensjonale metoder for separasjon av komplekse blandinger, ikke bare ved gelelektroforese, men også ved kromatografi og kapillærelektroforese.

for å forstå fremskrittene i todimensjonal SIDE (2D-SIDE), må man gå tilbake mye lenger enn et kvart århundre. I 1930 Tiselius introduserte flytte grensen metoden som et analytisk verktøy for å studere elektroforese av proteiner (2). Siden hans banebrytende arbeid har ulike former for elektroforese blitt brukt til separasjon av komplekse blandinger av proteiner, hver med forbedret oppløsning. Så tidlig som i 1962 viste Raymond Og Aurell (3) de signifikante ikke-lineære effektene av gelkonsentrasjon på elektroforetisk mobilitet av proteiner ved å benytte 2d elektroforese ved bruk av forskjellige akrylamidgelkonsentrasjoner for å separere serumproteiner. To år senere Viste Raymond (4) overlegenhet av flate plategeler sammenlignet med sylindriske rørgeler. For eksempel gir den flate platen maksimalt overflateareal for kjøling av gelen; de resulterende mønstrene er lettere å kvantifisere i standardopptakets densitometre; et stort antall prøver kan behandles ved hjelp av en enkelt gelplate, noe som letter direkte sammenligning av prøver behandlet under identiske forhold; og viktigst av alt, tillater den flate platen påføring av 2-D separasjoner. Disse innsiktsfulle preferansene har vist seg å være sanne og praktiseres i dag i mange bioanalytiske laboratorier.

En annen fremgang i 2-D gel separasjoner ble introdusert I 1972 Av Wright (5), som brukte en 4,75% (2% kryssbinding) polyakrylamid gel kolonne i den første dimensjonen, som deretter ble fjernet fra glasssylinderen og lagt på den øvre kanten av en 2% gradientplate. Etter elektroforese ble gelplaten plassert i en fargeløsning, noe som resulterte i visualisering av 112 oppløste humane serumproteiner.

disse nye tilnærmingene løste bare et lite antall proteiner, først og fremst de mest omfattende proteinene i en celle eller serumproteom. Innføringen AV 2d-SIDE i 1975 Av O ‘ Farrell (6) for å separere cellulære proteiner under denatureringsforhold aktivert oppløsningen av hundrevis av proteiner. Prinsippet som ble brukt var veldig enkelt: proteiner ble løst på en gel ved hjelp av isoelektrisk fokusering (IEF), som separerer proteiner i den første dimensjonen i henhold til deres isoelektriske punkt, etterfulgt av elektroforese i en annen dimensjon i nærvær av natriumdodecylsulfat (SDS), som separerer proteiner i henhold til deres molekylmasse. O ‘ Farrells metode er virkelig grunnlaget for moderne 2D-SIDE, som raskt ble tilpasset og allment akseptert av andre forskere. Anderson og Anderson (7) brukte 2D-SIDE for analyse av humane plasmaproteiner. De var i stand til å skille og oppdage omtrent 300 forskjellige protein flekker ved farging. I motsetning Til O ‘ Farrell separerte Manabe (8) humane plasmaproteiner VED HJELP AV 2D-SIDE uten denatureringsmidler. Omtrent 230 protein flekker kunne observeres på gelen; flekkene ble imidlertid smurt og ikke godt løst.

Innføring Av Immobiliserte pH-Gradienter

SOM nevnt ovenfor omfatter 2D-SIDE IEF i den første dimensjonen, etterfulgt AV SDS-SIDE i den andre dimensjonen. Siden Introduksjonen Av Kolin i 1954 (9) har IEF gjennomgått flere fremskritt. Den første dimensjonen utføres i polyakrylamidgelstenger som dannes i glass – eller plastrør og inneholder amfolytter som danner en pH-gradient i et elektrisk felt. Disse stengene var historisk uproduktiv, ustabil, og vanskelig å jobbe med. Innføring av immobiliserte pH gradienter (IPGs)Av Bjellqvist et al. (10) hadde en betydelig innvirkning på bruken av IEF for å separere komplekse blandinger over et bredt pH-område. IPGs muliggjorde dannelsen av stabile og reproduserbare pH-gradienter som kunne fokusere sure og basiske proteiner på en enkelt gel fremstilt med brede pH-gradienter. I IPGs er bæreramfolytene festet til akrylamidmolekyler og kastet inn i gelene for å danne en fast pH-gradient. Feste gradienten forhindrer drift i gelen og sikrer også at de kan støpes på en effektiv og reproduserbar måte. Ved hjelp AV smale ipg-striper ble det mulig å separere et større antall proteiner enn det som hadde vært mulig med standard 2D-SIDE fordi et smalere pH-område ble spredt over en større fysisk avstand. Denne spredningen tillot at proteiner med lignende isoelektriske punktverdier (pI) separeres med høyere oppløsning. For å illustrere dette punktet, Hoving et al. utviklet EN 2d-SIDEMETODE der DE brukte SMALE IPG-striper i den første dimensjonen (11). IPG-stripene var typisk 1-3 ph u brede og overlappet hverandre med minst 0,5 pH U. Seks IPG-striper som dekker pH-området på 3,5 til 10 ble brukt. Proteiner fra en b-lymfomcellelinje ble påført hver strimmel og separert ved BRUK av IEF. Hver stripe ble deretter påført en individuell sds-SIDE gelplate og proteiner ble separert i den andre dimensjonen basert på deres molekylvekt. Omtrent 5000 forskjellige flekker ble oppdaget ved hjelp av de seks IPG-stripene, sammenlignet med 1500 flekker oppdaget ved hjelp AV en ENKELT IPG-stripe med et pH-område på 3-10 og en enkelt standard 2d-SIDE gelplate. Wildgruber et al. (12) sammenlignet bruken av 3 IPG-striper med pH–områder på 4-5, 5-6 og 5,5-6,7 mot geler kjørt MED IPG-striper med pH-gradientområder på 3-10 og 4-7. De var i stand til å oppdage 2,3 og 1,6× flere proteinflekker ved hjelp av tre SMALE IPG-striper enn med DE to bredere gradientområdet IPG-stripene (henholdsvis 3-10 og 4-7).

mens høyere oppløsning oppnåelig ved hjelp av flere overlappende smale IPGs muliggjør identifisering av flere proteiner, krever hver smal strimmel en separat gelplate og en viss mengde av den samme prøven som skal lastes på hver. Dette kravet betyr at hvis prøvevolumet eller konsentrasjonen er begrenset, kan et slikt eksperiment ikke være mulig. For begrensede prøver bør et bredere pH-område eller et minimum antall Ipg-Er vurderes.

todimensjonal Differensial i gelelektroforese (2d-DIGE)

målet med å separere proteiner ved HJELP AV 2D-SIDE er todelt: (i) identifisere nye proteiner og (ii) måle deres relative overflod mellom komparative prøver. EN fordel MED 2D-SIDE som separasjonsteknikk er at det ikke bare løser et stort antall proteiner, men farging av disse proteinene gjør det mulig å kvantifisere de relative overflodene av proteinene. For eksempel blir proteiner ekstrahert fra to serumprøver (friske og syke) hver lastet på en separat gelplate. Etter farging blir proteinflettene justert og skannet for å måle deres individuelle intensiteter. Mens mange fremskritt i programvarejusteringsverktøy har blitt gjort, har det vært utfordrende å sikre direkte spot-to-spot sammenligning mellom to separate geler. Utviklingen av 2-D differensial i gelelektroforese (DIGE) i 1997 overvant denne begrensningen ved å tillate opptil tre forskjellige proteinblandinger å bli separert i en ENKELT 2d-SIDE gel (13). I et typisk 2d-DIGE-eksperiment er proteiner ekstrahert fra tre forskjellige prøver, sunn, syk og intern kontroll (en samlet prøve dannet ved å blande like mengder proteiner ekstrahert fra de friske og syke prøvene), kovalent merket, hver med et cyanin fluorescerende fargestoff som har en annen eksitasjons-og utslippsbølgelengde. Prøvene er migrasjon matchet, slik at det samme proteinet merket med noen av fargestoffer vil migrere til samme posisjon på gel. Cyaninfarger som har blitt brukt er: 1-(5-karboksypentyl)-1′-propylindokarbacyaninhalogenid N-hydroksysuccinimidylester (Cy3); 1-(5-karboksypentyl)-1′-metylindodikar-bacyaninhalogenid N-hydroksysuccinimidylester (Cy5); og 3-(4-karboksymetyl)fenylmetyl-3′-etyloksakarbacyaninhalogenid N-hydroksysuccinimidylester (Cy5) cy2). Like konsentrasjoner av de forskjellig merkede proteinene og kontrollprøven blandes, påføres på en enkelt gelplate og separeres VED HJELP AV 2D-SIDE. Kontrollprøven fungerer som en intern standard, som muliggjør både inter-og intra-gel matching. Kontrollprøven skal inneholde hvert protein som er tilstede i alle prøver i et eksperiment. Dette betyr at hvert protein i forsøket har et unikt signal i den interne standarden, som brukes til direkte kvantitative sammenligninger i hver gel og for å normalisere kvantitative overflodsverdier for hvert protein mellom geler. Skanning av gelen ved de spesifikke eksitasjonsbølgelengder av hvert fargestoff, ved hjelp av en fluorescens imager, tillater visualisering av differensielt merkede proteiner (Figur 1). Bildene blir deretter fusjonert og analysert ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare, noe som gjør det mulig å sammenligne forskjeller mellom overflodsnivåene av proteiner. Verdien i DIGE eliminerer eventuelle feil relatert til feiljustering av gel og sikrer nøyaktig kvantifisering (14).

Proteiner av interesse blir skåret ut fra gelen, proteolytisk fordøyd, og identifisert VED HJELP AV MS. SIDEN DET utføres ved hjelp av en enkelt gelplate, krever 2D-DIGE 50% færre geler, noe som gjør det mer økonomisk og forskjeller i proteinuttrykk mellom to forskjellige prøver av proteiner lettere å sammenligne og mer nøyaktig avbildet. I tillegg kreves mindre tid for å oppdage proteinflettene fordi merkingsreaksjonen I DIGE er raskere enn visualisering ved hjelp av fargemetoder. NÅR det er behov for å sammenligne proteinuttrykksnivåene for to forskjellige prøver, ER DIGE den valgte metoden (15).

Styrker og Svakheter VED 2D-SIDE

Elektroforese Er en etablert teknikk som har gjennomgått flere fremskritt som har forbedret oppløsning, deteksjon, kvantitasjon og reproduserbarhet. 2-D SDS-SIDE og 2D-DIGE tilnærminger til protein profilering er tilgjengelige og økonomiske metoder som har høy oppløsningsevne og muliggjør deteksjon av hundrevis av proteiner på en enkelt gelplate. Selv om reproduserbarhet har vært et problem MED 2D-SIDE, spesielt ved profilering av to proteinblandinger, har den blitt kraftig forbedret ved BRUK AV 2D-DIGE. Oppløsningen har blitt forbedret ved introduksjonen Av IPGs, som gjør det mulig for analytikeren å skreddersy pH-gradienten for maksimal oppløsning ved hjelp av ultrazoom-geler med et smalt ph-gradientområde. Med moderne 2D-SIDE er det ikke uvanlig å løse to proteiner som varierer i pI med 0.001 U.

SELV OM 2D-SIDE har blitt begrenset av manglende evne til å løse proteiner som er for grunnleggende eller for sure, for store Eller for små, reduseres denne begrensningen kontinuerlig. For eksempel kan separasjonen av basiske proteiner analyseres ved Hjelp Av IPGs i pH-området 4-12. Separasjonsvitenskapen utvikler seg alltid, og det vil ikke vare lenge før de gjenværende problemene med gelelektroforese er tilstrekkelig løst.

innføringen AV 2D-DIGE bidro enormt til å løse problemer med reproduserbarhet og kvantifisering. Bruken av imagers og datamaskiner tillater ikke bare rask datautvinning, oppkjøp og analyse, men også spotdeteksjon, normalisering, proteinprofilering, bakgrunnskorrigering og rapportering og eksport av data. Som en separasjons -, deteksjons-og kvantitasjonsteknikk er 2D-DIGE et viktig verktøy, spesielt for kliniske laboratorier involvert i bestemmelse av proteinuttrykksnivåer og sykdomsbiomarkørfunn. Når absolutt biologisk variasjon mellom prøver er hovedmålet, som i biomarkørfunn, ER 2D-DIGE den valgte metoden.

mens det har vært betydelige fremskritt i nongel (eller løsningsbaserte) metoder for kobling av fraksjoneringsmetoder direkte på nettet med MS-analyse, har 2D-PAGE forblitt en populær teknikk for å gjennomføre proteomiske studier. SELV OM 2D-SIDE, som enhver fraksjoneringsordning, har sine fordeler og ulemper, er DET ingen tvil om at DET vil forbli en viktig teknikk for karakterisering av proteomer i mange år framover.