factoren die binden aan de pro-COL1A2 proximale promotor
verschillende functionele CIS-acting elementen zijn geïdentificeerd in de ongeveer 400-bp proximale promotor van het pro-Col1a2 gen van de muis (154-2350 bp) en de minimale sequentie bij de mens tussen 152 en 2378 bp. De eerste transcriptiefactor gevonden om aan deze promotor te binden was het alomtegenwoordige ccaat-bindende eiwit CBF. Deze transcriptiefactor wordt gevormd door drie afzonderlijke subeenheden, genaamd A, B en C, die allemaal gekloond en gesequenced zijn (Maity en de Crombrugghe, 1998). Alle drie de subeenheden zijn nodig voor CBF om zich te binden aan de sequentie die de ccaat doos tussen 284 en 280 bevat en transcriptie te activeren in zowel menselijke als muizengenen (zie Fig. 13.2 B). In vitro gegevens suggereren dat de A en C subeenheden eerst associëren om een A–C complex te vormen en dat dit complex dan een heteromere molecule vormt met de B subeenheid (Sinha et al., 1995). Mutaties in de ccaat box die de binding van CBF voorkomen verminderen de transcriptionele activiteit van de pro-Col1a2 proximale promotor drie tot vijf keer in transiënte transfectie experimenten van fibroblastische cellijnen (Coustry et al., 1995). Gezuiverde CBF evenals CBF, samengesteld uit de drie recombinante subeenheden, activeren ook de pro-Col1a2-promotor in celvrije nucleaire extracten die eerder waren uitgeput van CBF (Coustry et al., 1995). Twee van de drie subeenheden van CBF bevatten transcriptionele activeringsdomeinen. Meer recent suggereerde een enkele substitutie van T naar een A in vivo in aanwezigheid van een upstream versterker van de menselijke sequentie dat CBF betrokken is bij het patrooniseren van de collageen type I expressie in zowel de dorsoventrale als de rostrocaudale as van muizenhuid fibroblasten (Tanaka et al., 2004).
naast de bindingsplaats voor CBF identificeerden footprinting-experimenten en gel-shift-studies andere bindingsplaatsen in de eerste 350 bp van de pro-Col1a2-promotor van de muis. Drie GC-rijke sequenties, gelokaliseerd op ongeveer 2160 bp (tussen 2176 en 2152 bp) en 2120 bp (tussen 2131 en 2114 bp) zijn aangetoond om te interageren met DNA-bindende eiwitten door voetafdruk experimenten en gel-shift assays (Hasegawa et al., 1996). Een schrapping in de muizenpromotor die deze drie footprintsequenties omvat, schafte de transcriptionele activiteit van de pro-Col1a2 proximale promotor volledig af in transiënte transfectie-experimenten met fibroblastische cellijnen. De overeenkomstige gebieden in de menselijke Pro-COL1A2 promotor werden ook beschermd in in vivo en in vitro footprinting experimenten (Ihn et al., 1996) en gebonden transcriptionele activatoren. Echter, gel-shift assays uitgevoerd met behulp van de menselijke Pro-COL1A2 promotor hebben gesuggereerd dat een cis-werkend element gelegen op 2160 bp een onderdrukkingselement vertegenwoordigt (Ihn et al., 1996), implicerend dat de interactie tussen proteã nen die met de activatorelementen bij 2300, 2125, en 280 bp in wisselwerking staan en proteã nen die aan een onderdrukkingselement bij 2160 bp binden dit gen regelen. Meer recent werd aangetoond dat CUX1, een ccaat-verdringingseiwit, geassocieerd is met verminderde expressie van type I collageen, zowel in vivo als in vitro, en dat verbetering van de expressie van CUX1 resulteert in effectieve onderdrukking van type I collageen door interferentie met CBF binding (Fragiadaki et al., 2011).Het is aangetoond dat
Sp1 en Sp3 het TCCTCC-motief tussen 2123 en 2128 bp binden; beide transcriptiefactoren activeren deze promotor (Ihn et al., 2001 )( zie Fig. 13.2 B). Bovendien binden eiwitten die zich binden aan de twee proximale segmenten ook aan het meest upstream GC-rijke segment, bij 2300 bp, met uitzondering van CBF, wat een redundantie suggereert tussen functioneel actieve DNA-segmenten van de pro-COL1A2 proximale promotor.
TGFß bemiddelt zijn werking in de menselijke promotor door de combinatie van de alomtegenwoordige transcriptiefactor Sp1, het Smad3/4-complex en de coactivatoren p300 / CREB-bindend eiwit (CBP) in wat een tgfß-responsief element (Tßre) wordt genoemd (Zhang et al., 2000). Dit segment bevat drie GC-rijke motieven tussen 2330 en 2255, geschikt voor het binden van Sp1, ccaat / enhancer-bindende eiwit (C / EBP), activator eiwit 1 (AP1), en Smad complexen (Chen et al., 1999, 2000a, b; Kanamaru et al., 2003; Tamaki et al., 1995; Zhang et al., 2000). Interactie tussen deze nucleaire factoren is synergetisch en vereist binding van Sp1 en Smad3 / 4 aan de GC-rijke elementen en de downstream Cagac Smad site, respectievelijk (Ghosh et al., 2000; Poncelet and Schnaper, 2001; Zhang et al., 2000). Rond de eeuwwisseling was er een groot debat over de vraag of Smads belangrijker zijn dan AP1 in de proximale promotor. Dit werd zo ‘ n 10 jaar later opgelost toen werd aangetoond dat TGFß ook het COL1A2-gen activeert via een niet-canonieke (smad-onafhankelijke) signaalweg, die samenwerking tussen versterker en promotor vereist, waarbij uitwisseling van C-Jun/JunB-transcriptiefactor bezetting van een kritische versterkerplaats nodig is, wat resulteert in de stabilisatie van versterker/promotor coalescentie (Ponticos et al., 2009). Een rapport waarin de effecten van hypoxie en TGFß op het COL1A2-gen worden onderzocht, heeft de potentiële rol van Smads, in het bijzonder Smad3, bij het reguleren van collageenexpressie, versterkt. Deze studies in menselijke mesangiale cellen suggereren dat onder hypoxische omstandigheden en in aanwezigheid van TGFß, hypoxie-induceerbare factor 1α (HIF-1α) en Smad3 transcriptionele complexen kunnen vormen en bij voorkeur de binding aan een van de drie hypoxie responselementen binnen de menselijke col1a2 promotor op positie -335 bp (Baumann et al., 2016). De auteurs suggereren dat deze nieuwe interactie zorgt voor een mechanisme dat verantwoordelijk is voor de synergie waargenomen tussen HIF en TGFß bij nierfibrose.TNFa en interferon-γ (IFN-γ) onderdrukken de matrixproductie. In tegenstelling tot het enige DNA-element dat tgfß stimulatie van de COL1A2 proximale promotor bemiddelt, is aangetoond dat zowel TNFa als IFN-γ col1a2 transcriptie remmen door de vorming van het tgfß-geïnduceerde complex te verstoren en door de interactie van negatieve factoren met responsieve DNA-elementen op 5′ en 3’ ervan te stimuleren. Dit zogenaamde “cytokine responsieve element” speelt een belangrijke rol bij het handhaven van homeostase. Betrokkenheid van AP1 en NF-kB bij het transduceren van de remmende werking van TNFa op COL1A2 genexpressie is aangetoond met behulp van vereeuwigde fibroblasten van muizen die noch de AP1 activator Jun n-terminaal kinase 1 (JNK1) noch de NF-kB essentiële modulator NEMO missen. Met name het verlies van JNK1 voorkwam het TNFa-antagonisme van TGFß, maar behield TNFa-remming van constitutieve col1a2-expressie. TGFß antagonisme door TNFa impliceert jnk1 phosphorylation van c-jun, leidend tot off-DNA concurrentie van de laatste molecuul voor smad3 die aan de verwante plaats van DNA binden en/of voor interactie met de P300 / CBP coactivators (Kouba et al., 1999; Verrecchia et al., 2001, 2002).
Binding van IFN-γ aan zijn receptoren leidt tot tyrosinefosforylering van janus kinase (JAK) tyrosine kinases en dit resulteert op zijn beurt in signaaltransducer en activator van transcriptie (STAT1) fosforylering. In COL1A2 resulteert STAT1-activering in competitie met Smad3 voor interactie met p300 / CBP (Inagaki et al., 2003). Daarnaast kan JAK1 ook transcriptiefactor y-box binding factor (YB-1) activeren; deze activering resulteert in zowel remming van constitutieve promotor activiteit door YB-1 binding van de 2125TC box en antagonisme van tgfß signalen door YB-1 competitie met Smad3 en/of P300/CBP (Ghosh et al., 2001; Higashi et al., 2003). Voor meer informatie, zie ” groeifactoren “en” Cytokines.”
Est1/Fli1 is ook aangetoond dat het dezelfde sequentie bindt met tegengestelde effecten op collageentype I-transcriptie. Een functionele ETS-transcriptiefactor werd geïdentificeerd in COL1A2 in de nabijheid van Sp1-locaties. Ets1 gestimuleerd, terwijl Fli1 geremd, promotor activiteit. De SP1-binding was essentieel voor de remming van Fli1. Bovendien leidde overexpressie van Fli1 in huidfibroblasten tot een afname van COL1A2 mRNA en eiwitspiegels (Czuwara-Ladykowska et al., 2001). Bovendien TGFß behandeling van dermale fibroblasten leidt tot dissociatie van Ets1 van de CBP / p300 complexen en verandert hun reactie op TGFß in het voordeel van matrixdegradatie (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).
bovendien is aangetoond dat een CpG–motief bij 17 bp bij voorkeur gemethyleerd is en gebonden is door RFX-eiwitten in cellen die een collageen-I-negatieve toestand krijgen. Celtransfectie experimenten in combinatie met DNA-binding assays hebben positieve of negatieve eigenschappen toegewezen aan elk van de eiwitten die binden aan de proximale promotor van pro-COL1A2 (Sengupta et al., 2002). De mate van methylation op de 17 CpG plaats, anderzijds, is getoond om de bindende affiniteit van RFX proteã nen te moduleren en, bijgevolg, hun capaciteit om promotoractiviteit te downreguleren door geassocieerde proteã nen te werven die in de assemblage van positief werkende transcriptional complexen interfereren (Xu et al., 2003, 2004).