C Methylerende middelen
de kruisgevoeligheid van bepaalde bacteriestammen voor UV-straling en het monofunctionele alkylerende middel MMS lijkt, in tegenstelling tot de tot nu toe besproken verbindingen, niet te wijten te zijn aan een soortgelijke herkenning van accijnsschade door dezelfde endonuclease die thymine-dimeren in DNA herkent. Het bestaan van bacteriële mutanten gevoelig voor MMS is prima facie bewijs voor het bestaan van herstelmechanismen in het wild type, maar het blijkt nu dat het niet een Gealkyleerde base per se die wordt herkend door een herstelmechanisme, maar waarschijnlijk een single-strengen breuk in DNA. Na MMS-behandeling werd B. subtilis geïnactiveerd door de vorming van single-streng breuken in DNA, waarvan werd aangetoond dat wild-type B. subtilis kan herstellen (Strauss en Wahl, 1964; Prakash en Strauss, 1970); een MMS-gevoelige mutant was echter ontoereikend of ontbrak in deze capaciteit. Bovendien werd aangevoerd dat de waargenomen kruisgevoeligheid voor UV-of x-stralen kan worden verklaard door de vorming van eenstrengbreuken waarvan bekend is dat ze door deze laatste stoffen worden gevormd.
bevestiging van dit standpunt werd verkregen uit de eigenschappen van een B. subtilis mutant die gevoelig was voor UV-straling maar niet voor MMS (Searashi and Strauss, 1965). Dat methylation van de basissen van DNA, eerder dan MMS-veroorzaakte bundelbreuken, geen uitsnijdingsreparatie in B oproept. subtilis werd ook duidelijk aangetoond door het niet waarnemen van een significant verlies van methylgroepen uit DNA van wild-type of gevoelige cellen gedurende meerdere celgeneraties. Deze bevinding wees op de capaciteit van cellen om geméthyleerd DNA te repliceren en is consistent met de replicatieve capaciteit van DNA die door arylalkylation wordt gewijzigd (Venitt en Tarmy, 1972).
bovenstaande studie over het herstel van MMS-geïnduceerde methyleringsschade bij B. subtilis kan daarom worden vergeleken met andere studies naar het herstel van alkyleringsschade die door de monofunctionele methylvormer MNNG (Lawley en Orr, 1970) in E. coli B/r wordt veroorzaakt. Dit product, alsmede 3-methyladenine en mogelijk sommige niet −geïdentificeerde producten (oorsprong materiaal op papier chromatogrammen) lijken selectief te worden verwijderd in vergelijking met verlies van N-7-methylguanine uit het DNA van E. coli B/r-cellen onder omstandigheden die zowel groei als DNA-synthese mogelijk maken. 3-Methyladenine en O-6–methylguanine, maar niet het oorspronkelijke materiaal, werden ook uit Bs-1-cellen verwijderd, maar mogelijk in een verlaagd tempo. Lawley en Orr hebben niet verklaard of er al dan niet een verschil in overleving was van met MNNG behandelde B/r-en Bs–1-cellen, wat erop zou kunnen wijzen dat dergelijke verschillen in excisie-capaciteit de werking weerspiegelen van een DNA-reparatiemechanisme dat de overleving van cellen bevordert. Echter, Kondo et al. (1970) geen verhoogde letaliteit of verhoogde mutatiefrequentie gemeld in E. coli, voor stammen die pyrimidine dimeren niet konden uitscheiden, na behandeling met MNNG, in vergelijking met MMS. Dit is ondanks het feit dat de alkylatie van DNA door MNNG 20 keer de hoeveelheid o 6-methylguanine produceert dan door alkylatie van DNA door MMS (Lawley et al., 1971–1972).
bewijs dat dit” verlies ” van 3-methyladenine en O 6-methylguanine wordt gemedieerd door een enzymatisch excisiemechanisme, dat verschilt van een UV-endonuclease, is afkomstig van in vitro studies naar de eigenschappen van een enzym, aangeduid als endonuclease II, geïsoleerd uit E. coli (Friedberg and Goldthwait, 1969). Dit enzym kan fosfodiësterbanden in DNA breken dat met de alkylerende agent MMS is gereageerd en ontpureerde plaatsen in DNA erkennen. Meer recent, werd het getoond om o 6-methylguanine en N 3-methyladenine vrij te geven maar niet N 7-methylguanine uit DNA dat door het carcinogene MNU was geméthyleerd (Kirtikar en Goldthwait, 1974). Endonuclease II bezit daarom duidelijk veel verschillende functies, waarvan er één in staat lijkt glycosidebindingen te verbreken die aan bepaalde gesubstitueerde purines zijn verbonden. Aan de andere kant kan het mogelijk een mengsel van enzymen zijn. Het bestaan van een enzym dat eveneens in staat is om deze veronderstelde splitsing van n-glycosidebindingen uit te voeren (en daarom N-glycosidase genoemd) is onlangs geïsoleerd uit E. coli en aangetoond dat het vrije uracil vrijmaakt uit DNA-bevattende gedeamineerde cytosineresiduen (Lindahl, 1974). De resulterende gedepurineerde plaats kan dan worden herkend en hersteld door een ander geassocieerd enzymsysteem (cf. Verly en Paquette, 1972). Specificiteit van een E. coli preparaat is ook waargenomen voor 3-alkyladenine maar niet voor 7-alkyladenine door Papirmeister et al. (1970). 3-Ethyladenine en O 6-ethylguanine maar niet N-7-ethylguanine residuen in DNA gevormd door de reactie van N-ethyl-N-nitrosoureum zijn gevonden om op dezelfde wijze worden verwijderd uit E. coli WP2 DNA (Lawley en Warren, 1975). De uitsnijding van de minder belangrijke produkten van purinealkylering is nu in zoogdiercellen in vivo waargenomen en bovendien is de verminderde uitsnijdingscapaciteit in bepaalde weefsels gecorreleerd met de identiteit van het doelorgaan voor sommige alkylerende carcinogenen (zie later Deel B, Deel I, C).Het kennelijke gebrek aan herkenning en excisie van residuen van N 7-alkylguanine in DNA door een reparatiemechanisme, zoals blijkt uit de studies van Prakash en Strauss (1970) en van Lawley en Orr (1970), was ook duidelijk in studies van Kimball et al. (1971a) over de effecten van MMS en MNNG in Haemophilus influenzae. Het is dan ook enigszins verrassend dat hetzelfde residu in Euglena gracilis voorkomt. Na methylering met N-methyl-N-nitroso-p-tolueensulfonaat werd 7-methylguanine uit DNA verloren met een halfwaardetijd van 10 uur (Olson en McCalla, 1969) die aanzienlijk korter is dan de halfwaardetijd van ongeveer 5 dagen voor spontane hydrolyse bij pH 7,4 in citroenzuurfosfaatbuffer (Margison et al., 1973). Bovendien heeft een resistente mutant de n −7-methylguanine blijkbaar sneller verwijderd dan de gevoelige stam, waarbij mononucleotiden uit afgebroken DNA in de cel supernatant verschijnen (Olson en McCalla, 1969). Deze onverwachte bevinding verdient derhalve nader onderzoek. Deze bevindingen, dan, samen met de lichte indicatie van een sneller verlies van 7-methylguanine uit rat lever DNA in vivo opgemerkt door Margison et al. (1973), maar niet door Craddock (1973a), zou kunnen suggereren dat deze DNA-substituent onder bepaalde omstandigheden door een reparatieenzym kan worden herkend.
tabel VI geeft een samenvatting van de voorgaande voorbeelden van het verlies van chemische produkten uit bacterieel DNA.