Een op regels gebaseerd model van de insuline-signaalweg / BMC systeembiologie

het model van de insuline-signaalweg

uitgaande van drie gepubliceerde modellen hebben we het model van ISP geïmplementeerd zoals afgebeeld in Fig. 1 met behulp van de systeembiologie grafische notatie .

het model omvat veel van de essentiële elementen die verantwoordelijk zijn voor de insulinewerking, aangezien de drie belangrijkste subroutes van de ISP, die hieronder kort worden beschreven, zijn opgenomen.

de PI3K-AKT-route

voor de PI3K-Akt-route verwijzen we meestal naar het model in Sedaghat et al. . Het model is gebruikt door verscheidene onderzoeksgroepen en omvat veel van de bekendste signalerende componenten die de translocatie van glucosetransporter GLUT4 bemiddelen. Deze omvatten de insuline receptor binding en recycle subsystemen; de post-receptor signalisatie subsysteem met inbegrip van zowel Ser-en Tyr-fosforylering op de insuline receptor substraat1 (IRS1); de vorming van een complex (IRS1_PI3K complex) tussen gefosforyleerd IRS1 en fosfatidylinositide 3-kinase (PI3K); de fosfatidylinositol 3,4,5-trisfosfaten PI(3,4,5) P3, synthese; de fosforylering van eiwitkinase B (AKT) en eiwitkinase C (PKC)-ζ; de translocatie van GLUT4 naar het plasmamembraan. Eiwit tyrosine fosfatase (PTP1B) en lipide fosfatasen (SHIP2 en PTEN) effecten worden ook overwogen in het model.

de TSC1 / 2-mTOR-route

voor de TSC1 / 2-mTOR-route verwijzen we meestal naar het model dat onlangs is gepubliceerd in Sonntag et al. , beschrijft het mTOR-effect in reactie op insuline en aminozuren. Het model beschouwt beide mTOR-complexen: mTORC1 en mTORC2. de mTORC1-activering is afhankelijk van de aanwezigheid van aminozuren en wordt geremd door de Tubereuze scleroseproteïnen 1 en 2 (TSC1/2)-activering (d.w.z. ser-fosforylering), die op zijn beurt afhangt van de 5′ AMP-geactiveerde proteïnekinase (AMPK) – activering. De activering van AMPK hangt van IRS1 Tyr phosphorylation af, terwijl de remming van TSC1 / 2 (d.w.z. Tyr phosphorylation) van AKT phosphorylation bij Thr309 afhangt. mTORC2, dat onlangs werd geÃ dentificeerd als het onbekende phosphoinositide-afhankelijke eiwitkinase 2 (PDK2), d.w.z. het kinase verantwoordelijk voor Ser474 phosphorylation van AKT, draagt bij aan de dubbele phosphorylation van AKT samen met thr309 phosphorylation, die door phosphoinositide-afhankelijke eiwitkinase 1 (PDK1) wordt in werking gesteld. Sonntag et al. formuleer de hypothese van de aanwezigheid van een PI3K-variant, die direct wordt geregeld door de geactiveerde insulinereceptor en op zijn beurt mTORC2 activeert. We hebben deze hypothese opgenomen in ons model.

de RAS-MAPK-route

voor de RAS-MAPK-route verwijzen we meestal naar het model in Borisov et al. het beschrijft zowel EGF als insuline stimulaties. Het model omvat alle belangrijke chemische mechanismen betrokken bij de RAS-MAPK Route: de interactie van Tyr gefosforyleerd IRS1 met SHP2 (het SH2 domein-bevattende tyrosine eiwit kinase 2) en GRB2-SOS complex (de groei factor receptor-gebonden 2 en de zoon van sevenless complex), waardoor de SHP2-IRS1 en GRB2/SOS-IRS1 complexen, respectievelijk; de GTP – binding van RAS; de fosforylatie van RAF proto-oncogene serine/threonine-eiwitkinase (C-RAF); de interactie van insulinereceptor met Ras GTPase activerende proteã ne (RASGAP), die op zijn beurt het omgekeerde proces van Ras deactivering katalyseert; de activering van proto-oncogene tyrosine-proteã ne kinase SRC die C-RAF volledig activeert; de dubbele specificiteit mitogen-geactiveerde kinase 1/2 (MEK1/2); de extracellulaire-signaal-geregelde kinasen (ERK1/2).

integratie van de PI3K-AKT, de TSC1/2-mTOR en de RAS-MAPK paden

de PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR en RAS-MAPK paden bevatten verschillende overlappende delen, die in de oorspronkelijke papers vaak op verschillende manieren werden gemodelleerd op basis van enigszins verschillende veronderstellingen. We vergeleken de overlappende reacties tussen verschillende modellen en implementeerden de meest up-to-date versie van hen op basis van de huidige kennis van cellulaire biochemie. Bovendien is de integratie van de drie modellen vereist die betrekking hebben op de verschillende meeteenheden die zijn gebruikt om de toestandsvariabelen te beschrijven. Terwijl immunoblot experimenten toelaten om belangrijke informatie over de tijdschaal van signaalgebeurtenissen te verkrijgen, zijn kwantitatieve informatie over eiwitexpressie vaak problematisch om zo terug te vinden dat de voorspelde concentratieprofielen soms in micromolaire concentratie worden gerapporteerd, zoals in Borisov et al. , of in willekeurige eenheden (AU), zoals in Sonntag et al. . In tegenstelling, in Sedaghat et al. de concentratie werd uitgedrukt in Molaire eenheden of in percentage van de totale concentratie (bv. de GLUT4-cytosolconcentratie werd beschouwd als 96 % van de totale GLUT4-concentratie in de cel bij de uitgangswaarde).

mogelijk maakt RBM het mogelijk om zowel deterministische als stochastische simulaties uit te voeren, op voorwaarde dat grootheden van variabelen worden uitgedrukt in kopieën van moleculen per cel. Zelfs als we in het huidige werk geen stochastische simulatie gebruikten, hebben we alle variabelen op dezelfde eenheid afgestemd, d.w.z. aantal moleculen per cellen, door vermenigvuldiging van de molaire eenheden met NA * V (NA geeft Avogadro nummer en V het celvolume, beschouwd als gelijk aan 3e-12 l). Alle details over eenheidsconversie uit AE en procentuele concentraties worden gegeven in materiaal en methoden.

het resulterende model bestaat uit 42 reactieregels en 101 parameters die de interacties tussen 61 verschillende chemische soorten coderen. Reacties, parameterwaarden en beginomstandigheden worden allemaal gerapporteerd in het aanvullende bestand 1.

nieuwigheden van het RBM-ISP-model

de implementatie van RBM vergemakkelijkt de verantwoording van een aantal van de ISP-kenmerken, zoals de fosforylering van signaaleiwitten op meerdere plaatsen en met meerdere effecten, de gelijktijdige interactie van moleculen met verschillende bindingspartners en de subcellulaire lokalisatie van sommige reacties. De hierboven genoemde kenmerken worden in het volgende in detail besproken.

fosforylering van signaalproteïnen op meerdere plaatsen

signaalmoleculen kunnen verschillende activiteitsniveaus hebben, afhankelijk van welke residuen gefosforyleerd zijn. Denk bijvoorbeeld aan IRS1 en AKT. IRS1 heeft vele residuen potentieel betrokken bij post-Vertalende wijzigingen en kan in zijn kinaseactie worden geactiveerd of geremd, afhankelijk van het gefosforyleerde residu dat Tyr of Ser is . Bijvoorbeeld, Tyr-896 phosphorylation wordt vereist voor de band van PI3K, SHP2 en GRB2, terwijl ser-636 phosphorylation door p70S6K een mechanisme met betrekking tot insulineresistentie is . AKT, in tegenstelling, kan door phosphorylation bij Thr309 of Ser474 door PDK1 en mTORC2, respectievelijk worden geactiveerd .

IRS1 phosphorylation dependent activation / inhibition was al opgenomen in het Sedeghat model, hoewel rekening werd gehouden met ser phosphorylation gereguleerd door PKC en niet door p70S6K, zoals in het Sonntag model. Hier hebben we zowel PKC als p70S6K acties gemodelleerd en pIRS1-Tyr896 complexe vorming/dissociatie beschreven met PI3K , SHP2 en GRB2 .

de twee fosforyleringslocaties van AKT werden niet expliciet gemodelleerd in Sedaghat et al. . We modelleerden de akt fosforylatie bij Thr gemedieerd door PI (3,4,5)P3 zoals in Sedaghat et al. model en de akt phosphorylation bij Ser gemedieerd door mTORC2 zoals in Sonntag et al. model en aangenomen:

I)
AKT gefosforyleerd op Thr of beide plaatsen om in te werken op het TSC1/2-complex door zijn fosforylering bij Tyr en defosforylering bij Ser te mediëren ;
ii)
AKT fosforylering op Ser of beide locaties om C-RAF te inactiveren;
iii)
AKT fosforylering bij Thr of Ser om GLUT4-translocatie te activeren .

interactie met meerdere bindingspartners

de interactie van de moleculen in de signaalwegen met talrijke verschillende bindingspartners resulteert in de potentiële vorming van verschillende complexen. In ISP, kan IRS1 phosphorylated bij Tyr-896 PI3K binden zoals gemodelleerd in Sedaghat et al. of GRB2 / SOS en SHP2, zoals gemodelleerd in Borisov et al. . Om de RBM-ISP modelspecificatie aan te passen aan de huidige kennis, hebben we de vorming van verschillende complexen toegestaan. Aldus, kan IRS1 op een wederzijds uitsluitende manier GRB2/SOS en SHP2 binden, maar kan tegelijkertijd GRB2/SOS en de regelgevende subeenheid P85 van PI3K binden .

informatie over subcellulaire lokalisatie in reactieregels

de mogelijkheid dat eiwitten moeten interageren is vaak gerelateerd aan hun fysieke lokalisatie, d.w.z. hun aanwezigheid in de extracellulaire ruimte, cytoplasma, kern, plasmamembraan, enz. Bijvoorbeeld, lipiden PI (3,4,5)P3 functie als plasma membraan docking sites die werven verschillende eiwitten die pleckstrine homologie (PH) domeinen (bijv. AKT en PDK1) en hun co-lokalisatie kunnen specifieke signaleringsgebeurtenissen versnellen . Een ander voorbeeld is de interactie van mTORC1 met de RAS-homoloog verrijkt in hersenen (RHEB) en Rag familie op lysosoommembraan, gemeld door Zoncu et al. . In ons model, we opgenomen de informatie over subcellulaire lokalisatie voor de insuline receptor en GLUT4 transporter, onderscheidend tussen hun plasmatische en cytoplasmische lokalisatie volgens de wiskundige beschrijving gegeven door Sedaghat et al. .

Modelvoorspellingen

de concentratieprofielen van alle chemische stoffen die het model bevolken, werden na 60 minuten, 100 nM insulinestimulatie gesimuleerd. De 100 nM concentratie vertegenwoordigt een goed geaccepteerd niveau van insuline stimulatie in celculturen algemeen gevonden in de literatuur en ook gebruikt door onze groep . Volgens Sonntag et al. we gingen ook uit van een constante aminozuren stimulatie, noodzakelijk om de mTORC1 activering en de feedback van P70S6K op IRS1 te verkrijgen. Om de betrouwbaarheid van het model te beoordelen, werden modelvoorspellingen vergeleken met experimentele gegevens die beschikbaar zijn in onze dataset voor sommige fosfoproteïnen op tijd 2, 5, 10, 30 en 60 minuten na insuline plus aminozuren, d.w.z. leucine, stimulatie . Zoals in Fig. 2, de experimentele en voorspelde profielen van pAKT-S473 en pmTORC1-S2448 zijn in goede overeenstemming, aangezien zij beiden een toenemend fosforylatiepatroon vertonen dat een steady state bereikt in respectievelijk de eerste 2-5 min en 20-30 min. Het voorspelde profiel voor ppERK1 / 2-Y202, Y204 wordt bevestigd door experimentele gegevens in de eerste 10 minuten, terwijl het in de laatste tijd snel afneemt in experimentele gegevens met betrekking tot modelvoorspellingen. Het profiel waargenomen in experimentele gegevens voor ppERK1 / 2-Y202, Y204, zou nauwer kunnen worden vergeleken door de sterkte van de feedback tussen ppERK1/2-Y202,Y204 en GRB2/SOS te vergroten. In Fig. 2 (rechterbovenpaneel, stippellijn), wordt het gesimuleerde profiel van ppERK1/2-Y202,Y204 verkregen door de parameter kcat39 (zie aanvullend bestand 1) te vermenigvuldigen met een factor 10 weergegeven. Merk op dat in het RBM ISP model dat online beschikbaar is, we besloten om de parameter van het model ongewijzigd te laten, dat wil zeggen we gebruiken de waarde uit de literatuur , uitstellen parameter optimalisatie voor toekomstige studies, wanneer verdere gegevens beschikbaar zullen zijn. Helaas, waren de experimentele gegevens van pP70S6K-T389 niet betrouwbaar (slechts één replicaat beschikbaar), zodat kunnen wij de experimentele en gesimuleerde profielen voor deze proteã ne niet vergelijken, die een eindpunt van de weg met een belangrijke feedback actie op IRS1 is. Toch is het gesimuleerde profiel weergegeven in Fig. 2 (onderste, rechter paneel) lijkt op experimentele gegevens getoond in andere papers .

We onderzochten de voorspelde profielen van alle actieve soorten en groepeerden ze in vier clusters volgens hun dynamisch gedrag, zoals blijkt uit Fig. 3:

Snelle reactie, het bereiken van de steady-state binnen 2-5 min (blue)
Snel overschrijding reactie, het bereiken van de piek binnen 2-5 min en dan de steady-state na 10-20 min (groene)
Trage reactie, het bereiken van de steady-state in 10-20 min (oranje)
Langzaam overschrijding van reacties, het bereiken van de piek in 5-10 min en de steady-state in 30-60 min (paars).

na insulinestimulatie reageert de insulinereceptor snel door fosforylering en een cascade van gebeurtenissen langs verschillende routes. Langs de PI3K-AKT weg, worden alle mechanismen strak met betrekking tot IRS1 Tyr – phosphorylation gekenmerkt door een snelle reactie. Hetzelfde geldt voor andere directe targets van IRS1 gefosforyleerd bij Tyr langs de tsc1/2-mTOR cascade, d.w.z. AMPK fosforylering bij t172, SHP2-IRS1 en GRB2/SOS-IRS1 complexenvorming. De snelle reactie wordt gekenmerkt door ofwel een snelle stijging van de steady state of door een voorbijgaande overschrijding gevolgd door de steady state conditie, afhankelijk van de afwezigheid/aanwezigheid van feedback mechanismen die op de doelmolecule (geval 1 en 2, in blauw en groen, respectievelijk, in Fig. 3). Mechanismen die meestal de tsc1/2-mTOR-route vormen en een rol spelen in ser-fosforylatie van IRS1 worden gekenmerkt door een relatief langzame niet-overschrijdende respons (geval 3, Oranje in Fig. 3). Zoals hierboven waargenomen, neemt de route RAS-MAPK in zijn upstream componenten een snelle reactie aan, die voor de downstream componenten merkbaar langzamer wordt (geval 4, Paars in Fig. 3).

in het algemeen worden moleculen stroomafwaarts van de route, gerelateerd aan relatief langzame processen zoals transcriptieactivering of interactie met de omgeving buiten de cel, zoals ERK1/2 en GLUT4, gekenmerkt door een langzame respons, terwijl moleculen stroomopwaarts van de route worden gekenmerkt door een snelle respons, zodat een snelle signaalvermeerdering wordt opgewekt. In dit verband kan de overshooting reactie gevolgd door de terugkeer naar een steady state helpen om een snelle signaalvoortplanting op één signaleringsroute te bereiken, waardoor moleculen onmiddellijk daarna weer beschikbaar zijn voor andere signaleringsroutes.

Modelvoorspellingen bij afwezigheid van controlemechanismen

vervolgens werden een aantal simulaties uitgevoerd om de robuustheid van het systeem te onderzoeken op twee doeleffecten van ISP: GLUT4-translocatie en erk1/2-fosforylering. In het bijzonder werd de rol van twee belangrijke controlemechanismen bij het reguleren van de doeleffecten geanalyseerd.:

p70s6k-IRS1 negatieve terugkoppelingslus (rode lijn in Fig. 1);
erk1/2-GRB2 / SOS negatieve terugkoppelingslus (Blauwe Lijn in Fig. 1);

hiertoe werd het tijdsverloop van GLUT4-en ERK1/2-respons in aanwezigheid en afwezigheid van de twee hierboven genoemde reguleringsmechanismen vergeleken (Fig. 4). De dynamiek van dubbel gefosforyleerd ERK1 / 2 wordt sterk beïnvloed door zowel p70s6k-IRS1 als erk1/2-GRB2/SOS negatieve terugkoppellijnen. Aan de andere kant worden de steady state en het dynamische gedrag van GLUT4 in membraan niet beïnvloed door ERK1/2, maar sterk beïnvloed door p70s6k-IRS1 negatieve terugkoppelingslus, waardoor het opmerkelijke belang van dit laatste controlemechanisme bij het bepalen van de systeemdynamiek wordt bevestigd.

het is bekend dat insulineresistentie gepaard gaat met defecten in IRS-afhankelijke signalering, wat zijn dysregulatie in de initiatie en progressie van metabole ziekte impliceert. Een opkomende visie is dat de positieve/negatieve regulatie van IRS door autologe routes bij ziekte wordt ondermijnd door verhoogde basale en andere tijdelijk ongeschikte serine/threonine fosforylaties , die leiden tot een verminderde glucoseopname. Compenserende hyperinsulinemie kan op dit punt toenemen en uiteindelijk leiden tot diabetes. Hoewel IRS1 (en IRS2) worden geregeld door een complex mechanisme waarbij fosforylatie van meer dan 50 verschillende serine/threonine residuen, in ons model p70s6k-IRS1 negatieve feedback lijn lijkt essentieel voor een goede controle van glucose opname. De verhoging van p70s6k-IRS1 negatieve terugkoppelingslus kan een verminderde insulinegevoeligheid en glucoseopname verklaren (Fig. 5). Evenzo (hoewel ze ook een positieve feedback van mTOR aan een ander IRS1 Serine residu hypothesen), Brännmark et al. aan de hand van een minimaal model van insulinesignalering blijkt dat een verminderd positief feedbackmechanisme een verminderde glucoseopname kan verklaren.

Aan de andere kant, zowel P70S6K-IRS1 en ERK1/2-GRB2/SOS negatieve feedback loops lijkt het essentieel om te garanderen dat dubbel gefosforyleerd ERK toont een transient gedrag, met een piek op 10 min gevolgd door een terugkeer naar de referentietoestand. Dit gedrag is al gemeld in de literatuur onder insuline stimulus en onder epidermale groeifactor stimulus . Een voorbijgaande ERK-respons verhindert een aanhoudende activering van ERK die in voortdurende celproliferatie zou resulteren .

gevoeligheidsanalyse

om de rol van de twee belangrijkste controlemechanismen bij het reguleren van de doeleffecten verder te onderzoeken, werd een lokale gevoeligheidsanalyse uitgevoerd door een kleine verstoring toe te passen (0.1% van de parameterwaarde) aan één modelparameter tegelijk en de resulterende relatieve veranderingen van GLUT4-translocatie en erk1/2-fosforylering evalueren (zie methoden). De tabellen 1 en 2 tonen de gevoeligheidscoëfficiënten van de modelparameters, gerangschikt overeenkomstig hun absolute waarde en vergeleken met de waarde die de coëfficiënten aannemen bij het verwijderen van p70s6k-IRS1 en erk1/2-GRB2/SOS negatieve terugkoppelingslussen. Deze coëfficiënten meten het totale effect, d.w.z. tijdens het observatievenster, van een parameterverandering op de uitkomst, d.w.z. GLUT4-en ERK-respons. Positieve / negatieve waarden betekenen dat het verhogen van de parameterwaarde het effect heeft van het verbeteren/verminderen van de respons. Aangezien kleine absolute waarden betekenen dat de parameterveranderingen de uitkomst niet significant beïnvloeden, worden in de tabellen 1 en 2 alleen de coëfficiënt groter dan 0,1 % (absolute waarde), hetzij in het oorspronkelijke, hetzij in het gewijzigde model, gerapporteerd.

Tabel 1 parametrische gevoeligheidsanalyse van het complete model voor GLUT4-membraantranslocatie

Tabel 2 parametrische gevoeligheidsanalyse van het volledige model voor erk1 / 2-activering

parametrische gevoeligheidsanalyse van het complete model voor GLUT4 respons toont aan dat de meest gevoelige parameters gerelateerd zijn aan GLUT4 translocatie naar plasmamembraan, gevolgd door die gerelateerd aan lipidenvorming en IRS1_PI3K complexe vorming/dissociatie. De afwezigheid van p70s6k_irs1 feedback heeft een sterke invloed op het vergroten van de gevoeligheid (absolute waarde) van parameters met betrekking tot lipidenvorming en IRS1_PI3K complexe vorming/dissociatie.

Parameters gerelateerd aan baseline IRS1 fosforylering/dephosphorylering bij Tyr/Ser, hebben een lagere gevoeligheid, die in het algemeen afneemt (absolute waarde) door het verwijderen van p70s6k-IRS1 feedback, met uitzondering van parameter k7p, gerelateerd aan IRS1 fosforylering bij Ser. Parameters met betrekking tot PKC gemedieerde IRS1 fosforylatie bij Ser tonen ook verhoogde waarden na verwijdering van p70s6k-IRS1 feedback. Aangezien erk1/2-GRB2 / SOS feedbackverwijdering geen effect heeft op GLUT4-translocatie, veranderen de gevoeligheidscoëfficiënten niet met en zonder deze feedback.

parametrische gevoeligheidsanalyse van het volledige model voor ERK1 / 2 respons toont aan dat de meest gevoelige parameters gerelateerd zijn aan RAS, MEK en RAF activering en aan IRS1 fosforylering bij Tyr en Ser, deze laatste gemedieerd door p70S6K.langs zowel de PI3K-AKT als de RAS-ERK1/2 Route lijkt erk1/2-GRB2/SOS feedback een belangrijke rol te spelen op de robuustheid van het systeem. De systeemdynamiek wordt zwak beïnvloed door zijn afwezigheid (zie Fig. 4), terwijl de parametergevoeligheid in bijna alle gevallen toeneemt (in absolute waarde) als deze feedback wordt verwijderd.

conclusies over het effect van p70s6k-IRS1-feedback op ERK1/2-respons zijn controversiëler. Het verwijderen van dit terugkoppelt heeft het effect van het verminderen van parametergevoeligheid langs pi3k_akt weg, terwijl, langs ras-erk1/2 weg, het bijna geen effect voor parameters met betrekking tot mek phosphorylation, RAF inactivation en ERK phosphorylation heeft. Het vermindert de gevoeligheid voor parameters met betrekking tot RAS, RAF activering en IRS1-GRB2/SOS en IRS1-SHP2 complexe verstoring. Het vergroot sterk de gevoeligheid van parameters met betrekking tot SRC en RAF activering.

deze resultaten benadrukken de centrale rol van negatieve terugkoppelingslussen bij het bepalen van niet alleen de dynamiek van een biologisch systeem, maar ook de robuustheid ervan. Deze eigenschap is van Opmerkelijk belang omdat zij het dynamische gedrag van het systeem tegen lawaai en kleine biologische schommelingen gewoonlijk als gevolg van intercellulaire variabiliteit bewaart.

een op regels gebaseerd model van de insuline-signaalweg