Tweedimensionale polyacrylamidegelelektroforese (2D-pagina): advances and perspectives

Inleiding

de laatste 25 jaar, en in het bijzonder de laatste tien jaar, is er een toegenomen inspanning geleverd om technologieën te ontwikkelen die in staat zijn grote aantallen eiwitten die in een celsysteem (d.w.z. het proteoom) tot expressie komen, te identificeren en te kwantificeren, in de hoop bijvoorbeeld biomarkers van ziekten te detecteren, eiwitcircuits in kaart te brengen of nieuwe fosforyleringslocaties te identificeren. De complexiteit van proteome heeft het ontwikkelen van methodes voor efficiënte scheiding en gevoelige opsporing van proteã nen een kritieke component van deze inspanning gemaakt. De voortdurende vooruitgang in de technologie van de massaspectrometrie (MS) heeft de opsporing van proteã nen met veel grotere snelheid en gevoeligheid toegelaten dan eerder mogelijk. Zelfs cutting-edge MS, echter, is niet in staat om alle componenten binnen een complex proteome te karakteriseren. De wetenschappers nemen een” verdeel en overwin ” benadering om proteomes te karakteriseren, in die zin dat zij proberen om tijdelijk het aantal proteã nen te beperken dat de massaspectrometer wordt gevraagd om te analyseren. Door proteome uit te spreiden, zullen meer proteã nen uiteindelijk binnen een individueel experiment worden geanalyseerd.

om proteomen te scheiden, hebben wetenschappers elektroforetische en chromatografische technologieën gebruikt, afzonderlijk en in combinatie, en zowel offline als online. Hoewel deze inspanningen in de scheiding en identificatie van duizenden proteã NEN kunnen resulteren, kan geen enige methode alle proteã nen in proteome, wegens hun grote aantal en concentratie dynamische waaier oplossen. De scheidingen van de enige dimensie zijn ontoereikend voor het effectief oplossen van complexe eiwitmengsels. Dit feit werd meer dan een halve eeuw geleden erkend door Smithies en Poulik (1), die erkenden dat een combinatie van twee elektroforetische processen op een gel loodrecht een veel grotere mate van resolutie zou moeten geven dan met beide afzonderlijk mogelijk is. De twee elektroforetische processen zijn resolutie door moleculaire grootte en vrije oplossingsmobiliteit op een zetmeelgel. Hun voorspelling blijft waar en heeft de basis gevormd voor de ontwikkeling van orthogonale multidimensionale methodologieën voor de scheiding van complexe mengsels, niet alleen door gelelektroforese, maar ook door chromatografie en capillaire elektroforese.

om de vooruitgang in tweedimensionale pagina (2D-pagina) goed te begrijpen, moet men veel verder teruggaan dan een kwart eeuw. In 1930 introduceerde Tiselius de bewegende grensmethode als analytisch hulpmiddel voor het bestuderen van de elektroforese van eiwitten (2). Sinds zijn baanbrekend werk, zijn diverse vormen van elektroforese gebruikt voor de scheiding van complexe mengsels van proteã nen, elk met betere resolutie. Al in 1962 demonstreerden Raymond en Aurell (3) de significante niet-lineaire effecten van gelconcentratie op de elektroforetische mobiliteit van eiwitten door gebruik te maken van 2-D elektroforese met behulp van verschillende acrylamidegelconcentraties om serumeiwitten te scheiden. Twee jaar later demonstreerde Raymond (4) de superioriteit van platte plak gels in vergelijking met cilindrische tube gels. De platte plaat biedt bijvoorbeeld een maximale oppervlakte voor het koelen van de gel; de resulterende patronen zijn gemakkelijker te kwantificeren in standaardopnamedensitometers; een groot aantal monsters kunnen worden verwerkt met behulp van een enkele gelplaat, waardoor de directe vergelijking van monsters die onder identieke omstandigheden worden verwerkt, wordt vergemakkelijkt; en, het belangrijkste, de platte plaat maakt de toepassing van 2-D scheidingen mogelijk. Deze inzichtelijke voorkeuren zijn bewezen waar en worden vandaag de dag in vele bioanalytische laboratoria beoefend.

een andere ontwikkeling in 2-D gelscheidingen werd geïntroduceerd in 1972 door Wright (5), die een 4.75% (2% cross-linkage) polyacrylamide gel kolom in de eerste dimensie gebruikte, die vervolgens uit de glazen cilinder werd verwijderd en op de bovenrand van een 2% gradiënt plaat werd gelegd. Na elektroforese werd de gelplaat in een kleuringsoplossing geplaatst, resulterend in de visualisatie van 112 herstelde menselijke serumeiwitten.

deze nieuwe benaderingen verdwenen slechts een klein aantal eiwitten, voornamelijk de meest voorkomende eiwitten van een cel-of serumproteoom. De introductie van 2D-pagina in 1975 door O ‘ Farrell (6) voor het scheiden van cellulaire proteã nen onder denaturerende voorwaarden liet de resolutie van honderden proteã nen toe. Het toegepaste principe was zeer eenvoudig: de proteã nen werden opgelost op een gel gebruikend iso-elektrisch het concentreren (IEF), die proteã nen in de eerste dimensie volgens hun iso-elektrisch punt scheidt, gevolgd door elektroforese in een tweede dimensie in aanwezigheid van natriumdodecylsulfaat (SDS), die proteã nen volgens hun moleculaire massa scheidt. O ‘Farrell’ s methode is echt de basis van de moderne 2D-pagina, die snel werd aangepast en algemeen aanvaard door andere onderzoekers. Anderson en Anderson (7) gebruikten 2D-pagina voor de analyse van menselijke plasma-eiwitten. Zij konden ongeveer 300 verschillende eiwitvlekken op het bevlekken scheiden en ontdekken. In tegenstelling tot O ‘ Farrell scheidde Manabe (8) menselijke plasma-eiwitten met behulp van 2D-PAGE zonder denatureringsmiddelen. Ongeveer 230 eiwitvlekken konden op het gel worden waargenomen; nochtans, werden de vlekken uitgesmeerd en niet goed opgelost.

introductie van geïmmobiliseerde pH-gradiënten

zoals hierboven vermeld, omvat 2D-pagina IEF in de eerste dimensie, gevolgd door SDS-pagina in de tweede dimensie. Sinds de introductie door Kolin in 1954 (9) heeft IEF verschillende ontwikkelingen ondergaan. De eerste dimensie wordt uitgevoerd in polyacrylamidegelstaven die worden gevormd in glazen of plastic buizen en ampholytes bevatten die een pH-gradiënt in een elektrisch veld vormen. Deze staven waren historisch niet reproduceerbaar, onstabiel en moeilijk om mee te werken. De introductie van geïmmobiliseerde pH-gradiënten (IPGs) door Bjellqvist et al. (10) had een aanzienlijke invloed op het gebruik van IEF voor het scheiden van complexe mengsels over een breed pH-bereik. IPGs liet de vorming van stabiele en reproduceerbare pH gradiënten toe geschikt om zure en basische proteã nen op één enkel gel te concentreren dat met brede pH gradiënten wordt voorbereid. In IPGs, zijn de dragerampholytes in bijlage aan acrylamidemolecules en gegoten in de gels om een vaste pH-gradiënt te vormen. Het bevestigen van de gradiënt voorkomt drift in de gel en zorgt er ook voor dat ze op een efficiënte en reproduceerbare manier kunnen worden gegoten. Gebruikend smal-waaier IPG stroken stonden een groter aantal proteã nen toe om te worden gescheiden dan met standaard 2D-pagina mogelijk was geweest omdat een smallere pH waaier over een grotere fysieke afstand werd uitgespreid. Deze verspreiding stond proteã nen met gelijkaardige isoelectric punt (pI) waarden toe om met hogere resolutie worden gescheiden. Om dit punt te illustreren, Hoving et al. ontwikkelde een 2D-pagina methode waarbij ze smal-range IPG strips in de eerste dimensie (11). De IPG strips waren meestal 1-3 pH u breed en overlapten elkaar met ten minste 0,5 pH U. Er werden zes IPG strips gebruikt die een pH-bereik van 3,5 tot 10 hadden. De proteã nen van een B-lymfoomcellijn werden toegepast op elke strook en gescheiden gebruikend IEF. Elke strook werd toen toegepast op een individuele SDS-pagina gelplaat en de proteã nen werden gescheiden in de tweede dimensie die op hun molecuulgewicht wordt gebaseerd. Ongeveer 5000 verschillende spots werden gedetecteerd met behulp van de zes IPG-strips, vergeleken met 1500 spots gedetecteerd met behulp van een enkele IPG-strip met een pH-bereik van 3-10 en een enkele standaard 2D-pagina gelplaat. Wildgruber et al. (12) vergeleek het gebruik van 3 IPG–strips met pH-bereiken van 4-5, 5-6 en 5.5-6.7 tegen gels die worden uitgevoerd met IPG-strips met pH-gradiëntbereiken van 3-10 en 4-7. Zij konden 2.3 en 1.6× meer eiwitvlekken ontdekken gebruikend drie smal-waaier IPG stroken dan met de twee bredere gradiënt-waaier IPG stroken (3-10 en 4-7), respectievelijk.

terwijl de hogere resolutie die kan worden verkregen met meerdere overlappende smalle IPG ‘ s de identificatie van meer eiwitten mogelijk maakt, vereist elke smalle strook een aparte gelplaat en een bepaalde hoeveelheid van hetzelfde monster om op elke strook te worden geladen. Deze eis houdt in dat, indien het volume of de concentratie van het monster beperkt is, een dergelijk experiment mogelijk niet mogelijk is. Voor beperkte monsters moet een breder pH-bereik of een minimumaantal IPG ‘ s worden overwogen.

tweedimensionale differentiële in-gelelektroforese (2D-DIGE)

het doel van het scheiden van eiwitten met behulp van 2D-PAGE is tweeledig: (I) het identificeren van nieuwe eiwitten en (II) het meten van hun relatieve abundantie tussen vergelijkende monsters. Één voordeel van 2D-pagina als scheidingstechniek is het niet alleen grote aantallen proteã nen oplost, maar het bevlekken van deze proteã nen laat de relatieve overvloed van de proteã nen toe worden gekwantificeerd. Bijvoorbeeld, worden de proteã nen geëxtraheerd uit twee (gezonde en zieke) serummonsters elk geladen op een afzonderlijke gelplaat. Na het bevlekken, worden de eiwitvlekken uitgelijnd en gescand om hun individuele intensiteiten te meten. Hoewel veel vooruitgang in software-uitlijning tools zijn gemaakt, is het een uitdaging geweest om directe spot-to-spot vergelijking tussen twee afzonderlijke gels te garanderen. De ontwikkeling van 2-D differentiële in-gelelektroforese (DIGE) in 1997 overwon deze beperking door maximaal drie verschillende eiwitmengsels toe te staan om binnen één enkel 2D-pagina gel te worden gescheiden (13). In een typisch 2D-DIGE experiment, worden de proteã nen uit drie verschillende steekproeven, gezond, ziek, en interne controle (een gepoolde steekproef gevormd uit het mengen van gelijke hoeveelheden proteã nen uit de gezonde en zieke steekproeven wordt gehaald), covalent geëtiketteerd, elk met een cyanine fluorescente kleurstof die een verschillende opwinding en emissiegolflengte heeft. De steekproeven zijn migratie aangepast, zodat de zelfde die proteã ne met om het even welke kleurstoffen wordt geëtiketteerd naar dezelfde positie op het gel zal migreren. De gebruikte cyaninekleurstoffen zijn:: 1-(5-carboxy-pentyl)-1′-propylindocarbacyaninehalide N-hydroxysuccinimidylester(Cy3); 1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindodicar-bacyaninehalide n-hydroxysuccinimidylester(Cy5); en 3-(4-carboxymethyl)fenylmethyl-3′-ethyloxacarbacyaninehalide N-hydroxysuccinimidylester (cy2). De gelijke concentraties van de verschillend geëtiketteerde proteã nen en de controlesteekproef worden gemengd, toegepast op één enkele gelplaat, en gescheiden gebruikend 2D-pagina. De controlesteekproef dient als interne standaard, die zowel inter – als intra-gel matching mogelijk maakt. De controlesteekproef zou elke proteã ne moeten bevatten huidig over alle steekproeven in een experiment. Dit betekent dat elke proteã ne in het experiment een uniek signaal in de interne norm heeft, die voor directe kwantitatieve vergelijkingen binnen elk gel wordt gebruikt en om kwantitatieve overvloed waarden voor elke proteã ne tussen gels te normaliseren. Het aftasten van het gel bij de specifieke opwindingsgolflengten van elke kleurstof, gebruikend een fluorescentiebeeldcamera, staat visualisatie van de differentieel geëtiketteerde proteã nen toe (figuur 1). De beelden worden dan samengevoegd en geanalyseerd gebruikend weergavesoftware, die verschillen tussen de overvloed niveaus van te vergelijken proteã nen toelaat. De waarde in DIGE elimineert elke fout in verband met een verkeerde uitlijning van de gel en zorgt voor een nauwkeurige kwantificering (14).

de Proteã nen van belang worden uitgesneden uit het gel, proteolytically verteerd, en geà dentificeerd gebruikend MS. Aangezien het wordt uitgevoerd gebruikend één enkele gelplaat, vereist 2D-DIGE 50% minder gels, makend het economischer en verschillen in eiwituitdrukking tussen twee verschillende steekproeven van proteã NEN gemakkelijker te vergelijken en nauwkeuriger imaged. Bovendien wordt minder tijd vereist om de eiwitvlekken te ontdekken omdat de etiketteringsreactie in DIGE sneller is dan visualisatie gebruikend het bevlekken methodes. Wanneer er een behoefte is om de eiwituitdrukkingsniveaus van twee verschillende steekproeven te vergelijken, is DIGE de methode van keus (15).

sterke en zwakke punten van 2D-PAGE

elektroforese is een gevestigde techniek die verschillende vooruitgang heeft ondergaan die de resolutie, detectie, kwantificering en reproduceerbaarheid hebben verbeterd. De 2-D SDS-pagina en 2D-DIGE benaderingen van het eiwit profileren zijn toegankelijke en economische methodes die hoge het oplossen macht bezitten en de opsporing van honderden proteã nen op één enkele gelplaat toelaten. Hoewel de reproduceerbaarheid een probleem met 2D-pagina is geweest, vooral wanneer het profileren van twee eiwitmengsels, is het zeer verbeterd met het gebruik van 2D-DIGE. De resolutie is verbeterd door de introductie van IPGs, die de analist in staat stellen om de pH-gradiënt aan te passen voor maximale resolutie met behulp van ultrazoom gels met een smal pH-gradiëntbereik. Met moderne 2D-PAGE is het niet ongebruikelijk om twee eiwitten die verschillen in pI met 0,001 u

op te lossen hoewel 2D-PAGE beperkt is door zijn onvermogen om eiwitten op te lossen die te basisch of te zuur, te groot of te klein zijn, neemt deze beperking voortdurend af. Bijvoorbeeld, kan de scheiding van basisproteã nen worden geanalyseerd gebruikend IPGs in de pH waaier van 4-12. De scheidingswetenschap evolueert altijd, en het zal niet lang duren voordat de resterende kwesties van gelelektroforese adequaat worden opgelost.

de invoering van 2D-DIGE heeft enorm bijgedragen tot het oplossen van problemen op het gebied van reproduceerbaarheid en kwantificering. Het gebruik van imagers en computers maakt niet alleen snelle datamining, acquisitie en analyse mogelijk, maar ook spotdetectie, normalisatie, eiwitprofilering, achtergrondcorrectie en rapportage en export van gegevens. Als scheiding, opsporing, en kwantificatietechniek, is 2D-DIGE een belangrijk hulpmiddel, vooral voor klinische laboratoria betrokken bij de bepaling van eiwituitdrukkingsniveaus en de ontdekking van de ziektebiomarker. Wanneer de absolute biologische variatie tussen steekproeven het belangrijkste doel is, zoals in biomarkerontdekking, is 2D-DIGE de methode van keus.

hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in nongel (of oplossingsgebaseerde) methoden voor het direct online koppelen van fractioneringsmethoden met MS-analyse, is 2D-PAGE nog steeds een populaire techniek voor het uitvoeren van proteomische studies. Hoewel 2D-pagina, zoals om het even welke fractioneringsregeling, zijn voor-en nadelen heeft, is er geen twijfel dat het een essentiële techniek voor de karakterisering van proteomes voor vele komende jaren zal blijven.