A rule-based model of insulin signalling pathway / BMC Systems Biology

the model of insulin signalling pathway

zaczynając od trzech opublikowanych modeli , wdrożyliśmy model ISP, jak pokazano na Fig. 1 Korzystanie z notacji graficznej biologii systemów .

model ten zawiera wiele istotnych elementów odpowiedzialnych za działanie insuliny, ponieważ uwzględniono trzy główne pod-drogi przemian ISP, krótko opisane w poniższej tabeli.

ścieżka PI3K-AKT

w przypadku ścieżki PI3K-Akt najczęściej odwołujemy się do modelu w Sedaghat et al. . Model ten był wykorzystywany przez kilka grup badawczych i zawiera wiele najbardziej znanych elementów sygnalizacyjnych pośredniczących w translokacji transportera glukozy GLUT4. Należą do nich podsystemy wiązania i recyklingu receptora insulinowego; podsystem sygnalizacji post-receptorowej obejmujący zarówno fosforylację Ser – i Tyr w substracie receptora insulinowego 1 (IRS1); tworzenie kompleksu (irs1_pi3k complex) między fosforylowanym IRS1 a kinazą 3-fosfatydyloinozytydową(PI3K); 3,4,5-trisfosforany fosfatydyloinozytolu PI (3,4,5)P3, syntezę 3,4,5-trisfosforanów; fosforylacja kinazy białkowej B (AKT) i kinazy białkowej C (PKC)-ζ; translokacja GLUT4 do błony plazmatycznej. W modelu uwzględniono również efekty białkowej fosfatazy tyrozynowej (PTP1B) i fosfatazy lipidowej (SHIP2 i PTEN).

ścieżka TSC1/2-mTOR

w przypadku ścieżki TSC1/2-mTOR odwołujemy się głównie do modelu opublikowanego niedawno w Sonntag et al. , opisując efekt mTOR w odpowiedzi na insulinę i aminokwasy. Model uwzględnia oba kompleksy mTOR: mTORC1 i mtorc2. aktywacja mTORC1 zależy od obecności aminokwasów i jest hamowana przez aktywację białek stwardnienia guzowatego 1 i 2 (TSC1 / 2) (tj. fosforylację Ser), która z kolei zależy od aktywacji kinazy białkowej aktywowanej 5′ AMP (AMPK). Aktywacja AMPK zależy od fosforylacji IRS1 Tyr, podczas gdy hamowanie TSC1 / 2 (tj. fosforylacja Tyr) zależy od fosforylacji AKT w thr309. mTORC2, który został niedawno zidentyfikowany jako nieznana kinaza białkowa zależna od fosfoinozydy 2 (PDK2), tj. kinaza odpowiedzialna za fosforylację SER474 AKT, przyczynia się do podwójnej fosforylacji AKT wraz z fosforylacją Thr309, prowadzoną przez kinazę białkową zależną od fosfoinozydy 1 (PDK1). Sonntag et al. sformułuj hipotezę obecności wariantu PI3K, który jest bezpośrednio regulowany przez aktywowany receptor insuliny i z kolei aktywuje mTORC2. Włączyliśmy tę hipotezę do naszego modelu.

ścieżka RAS-MAPK

w przypadku ścieżki RAS-MAPK odnosimy się głównie do modelu w Borysowie i in. , opisujące zarówno stymulację EGF, jak i insulinową. Model obejmuje wszystkie główne mechanizmy chemiczne zaangażowane w Szlak RAS-MAPK: interakcję fosforylowanego Tyr IRS1 z SHP2 (kinazą białkową tyrozynową 2 zawierającą domenę SH2) i kompleksem GRB2-SOS (związanym z receptorem czynnika wzrostu 2 i synem kompleksu sevenless), tworząc w ten sposób odpowiednio kompleksy SHP2-IRS1 i GRB2/SOS-IRS1; Wiązanie GTP RAS; fosforylacja protoonkogenowej seryny RAF/treoniny-irs1. kinaza białkowa (C-RAF); interakcja receptora insulinowego z białkiem aktywującym Ras Gtpazę (RASGAP), które z kolei katalizuje odwrotny proces dezaktywacji Ras; aktywacja protoonkogenowo-tyrozynowo-białkowej kinazy SRC, która w pełni aktywuje C-RAF; kinaza aktywowana mitogenem o podwójnej specyficzności 1/2 (MEK1/2); kinazy regulowane sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK1/2).

Integracja ścieżek PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR i RAS-MAPK

ścieżki PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR i RAS-MAPK zawierają kilka nakładających się części, które w oryginalnych opracowaniach były często modelowane na różne sposoby, opierając się na nieco innych założeniach. Porównaliśmy nakładające się na siebie reakcje w różnych modelach i wdrożyliśmy ich najbardziej aktualną wersję w oparciu o aktualną wiedzę z zakresu biochemii komórkowej. Ponadto integracja trzech modeli wymagała uwzględnienia różnych jednostek miary przyjętych do opisu zmiennych stanu. Podczas gdy eksperymenty immunoblot pozwalają uzyskać ważne informacje dotyczące skali czasowej zdarzeń sygnałowych, informacje ilościowe na temat ekspresji białka są często problematyczne do pobrania, tak że przewidywane profile stężeń są czasami zgłaszane w stężeniu mikromolarnym, jak w Borisov et al. , lub w dowolnych jednostkach (AU), jak w Sonntag et al. . Natomiast w Sedaghat et al. stężenie wyrażano w jednostkach molowych lub w procentach całkowitego stężenia (np. stężenie cytozolu GLUT4 uznano za 96% całkowitego stężenia GLUT4 w komórce w stanie wyjściowym).

potencjalnie, RBM umożliwia wykonywanie zarówno deterministycznych, jak i stochastycznych symulacji, pod warunkiem, że wielkości zmiennych są wyrażone w kopiach cząsteczek na komórkę. Nawet jeśli w niniejszej pracy nie wykorzystaliśmy symulacji stochastycznej, to wszystkie zmienne dopasowaliśmy do tej samej jednostki, tj. liczba cząsteczek na komórki, przez pomnożenie jednostek molowych przez NA * V (NA oznacza liczbę Avogadro, A V objętość komórki, uważaną za równą 3e-12 l). Wszystkie szczegóły dotyczące konwersji jednostek z AU i stężeń procentowych podano w materiale i metodach.

powstały model składa się z 42 zasad reakcji i 101 parametrów kodujących interakcje między 61 różnymi gatunkami chemicznymi. Reakcje, wartości parametrów i warunki początkowe są zgłaszane w dodatkowym pliku 1.

Nowości modelu RBM-ISP

implementacja RBM ułatwiła uwzględnienie wielu cech ISP, takich jak fosforylacja białek sygnałowych w wielu miejscach i z wieloma efektami, jednoczesne oddziaływanie cząsteczek z różnymi partnerami wiążącymi i subkomórkowa lokalizacja niektórych reakcji. Wyżej wymienione cechy są szczegółowo omówione w poniższym.

fosforylacja białek sygnałowych w wielu miejscach

cząsteczki sygnałowe mogą mieć różne poziomy aktywności, w zależności od tego, które reszty są fosforylowane. Rozważmy na przykład IRS1 i AKT. IRS1 zawiera wiele pozostałości potencjalnie zaangażowanych w modyfikacje potranslacyjne i może być aktywowany lub hamowany w działaniu kinazy, w zależności od fosforylowanej reszty Tyr lub Ser . Na przykład fosforylacja Tyr-896 jest wymagana dla wiązania PI3K, SHP2 i GRB2, podczas gdy fosforylacja Ser-636 przez p70S6K jest mechanizmem związanym z insulinoopornością . AKT natomiast może być aktywowany przez fosforylację w thr309 lub Ser474 odpowiednio przez PDK1 i MTORC2 .

aktywacja/inhibicja zależna od fosforylacji IRS1 została już uwzględniona w modelu Sedeghat, chociaż biorąc pod uwagę fosforylację Ser regulowaną przez PKC, a nie przez p70S6K, jak w modelu Sonntag. Tutaj modelowaliśmy zarówno działania PKC, jak i p70s6k i opisaliśmy tworzenie / dysocjację kompleksu pIRS1-Tyr896 z PI3K, SHP2 i GRB2 .

dwa miejsca fosforylacji AKT nie były wyraźnie modelowane w Sedaghat et al. . Modelowaliśmy fosforylację AKT w thr za pośrednictwem PI (3,4,5) P3, jak w Sedaghat et al. model i AKT fosforylacji w Ser pośredniczony przez mTORC2 jak w Sonntag et al. model i zakładane:

i)
AKT fosforylowany w Thr lub w obu miejscach do działania na kompleks TSC1/2 poprzez mediację jego fosforylacji w Tyr i defosforylacji w Ser ;
ii)
fosforylacja AKT w Ser lub w obu miejscach w celu inaktywacji C-RAF ;
iii)
fosforylacja AKT przy Thr lub Ser w celu aktywacji translokacji GLUT4 .

interakcja z wieloma partnerami wiążącymi

interakcja cząsteczek w szlakach sygnałowych z wieloma różnymi partnerami wiążącymi skutkuje potencjalnym tworzeniem różnych kompleksów. W ISP, irs1 fosforylowane w Tyr-896 może wiązać PI3K jak modelowane w Sedaghat et al. lub GRB2 / SOS i SHP2, jak modelowane w Borisov et al. . Aby dopasować specyfikację modelu RBM-ISP do aktualnej wiedzy, pozwoliliśmy na tworzenie różnych kompleksów. Tak więc IRS1 może wiązać się w wzajemnie wykluczający się sposób GRB2 / SOS i SHP2, ale może wiązać jednocześnie GRB2 / SOS i podjednostkę regulacyjną P85 PI3K .

informacja o lokalizacji subkomórkowej w regułach reakcji

możliwość interakcji białek jest często związana z ich lokalizacją fizyczną, tj. ich obecnością w przestrzeni pozakomórkowej, cytoplazmie, jądrze, błonie plazmatycznej itp. Na przykład lipidy PI(3,4,5)P3 działają jako miejsca dokowania błon osoczowych, które rekrutują różne białka zawierające domeny homologiczne pleckstriny (PH) (np. AKT i PDK1) i ich współlokalizacja może przyspieszyć określone zdarzenia sygnalizacyjne . Innym przykładem jest interakcja mTORC1 z homologem Ras wzbogaconym w mózg (RHEB) i rodziną Rag na błonie lizosomu, opisana przez Zoncu i wsp. . W naszym modelu uwzględniliśmy informacje o lokalizacji subkomórkowej receptora insuliny i transportera GLUT4, rozróżniając ich lokalizację plazmatyczną i cytoplazmatyczną zgodnie z opisem matematycznym podanym przez Sedaghata i wsp. .

przewidywania modelu

profile stężeń wszystkich gatunków chemicznych wypełniających model symulowano po 60 minutach stymulacji insuliną 100 nM. Stężenie 100 nM reprezentuje dobrze przyjęty poziom stymulacji insuliny w hodowlach komórkowych powszechnie spotykany w literaturze i stosowany również przez naszą grupę . Według Sonntag et al. , zakładaliśmy również stałą stymulację aminokwasów, niezbędną do uzyskania aktywacji mTORC1 i sprzężenia zwrotnego p70S6K na IRS1. Aby ocenić wiarygodność modelu, porównano przewidywania modelu z danymi eksperymentalnymi dostępnymi w naszym zbiorze danych dla niektórych fosfoprotein w czasie 2, 5, 10, 30 i 60 minut po stymulacji insuliną i aminokwasami, tj. leucyną . Jak pokazano na Fig. 2, eksperymentalne i przewidywane profile pAKT – s473 i pmTORC1-s2448 są w dobrej zgodzie, ponieważ oba wykazują zwiększający się wzór fosforylacji osiągając stan stacjonarny odpowiednio w pierwszych 2-5 minutach i 20-30 minutach. Przewidywany profil dla ppERK1/2-Y202, Y204 jest potwierdzony przez dane eksperymentalne w pierwszych 10 minutach, podczas gdy w ostatnich punktach czasowych gwałtownie zmniejsza się w danych eksperymentalnych w odniesieniu do przewidywań modelowych. Profil obserwowany w danych doświadczalnych dla ppERK1/2-Y202,Y204, może być bardziej dopasowany poprzez zwiększenie siły sprzężenia zwrotnego między ppERK1/2-Y202,Y204 i GRB2 / SOS. Na Rys. 2 (prawy górny panel, linia przerywana), pokazano symulowany profil ppERK1/2-Y202,Y204 otrzymany przez pomnożenie parametru kcat39 (zob. dodatkowy plik 1) przez współczynnik 10. Zauważ, że w modelu RBM ISP dostępnym online zdecydowaliśmy się pozostawić parametr modelu bez zmian, tzn. wykorzystujemy wartość z literatury, odkładając optymalizację parametrów na przyszłe badania , kiedy będą dostępne dalsze dane. Niestety, dane doświadczalne pP70S6K-T389 nie były wiarygodne(dostępny jest tylko jeden replikat), więc nie możemy porównać eksperymentalnych i symulowanych profili tego białka, które jest punktem końcowym Szlaku z ważnym działaniem sprzężenia zwrotnego na IRS1. Niemniej jednak symulowany profil pokazany na Fig. 2 (dolny, prawy panel) przypomina dane eksperymentalne pokazane w innych pracach .

zbadaliśmy przewidywane profile wszystkich aktywnych gatunków i zgrupowaliśmy je w cztery skupiska zgodnie z ich dynamicznym zachowaniem, jak pokazano na Fig. 3:

szybka reakcja, osiągnięcie stanu stacjonarnego w ciągu 2-5 minut (niebieski)
szybka reakcja przeciążenia, osiągając szczyt w ciągu 2-5 minut, a następnie stan stacjonarny po 10-20 minut (zielony)
powolna odpowiedź, osiągając stan stacjonarny w ciągu 10-20 minut (pomarańczowy)
powolne przekroczenia odpowiedzi, osiągając szczyt w 5-10 min i stan stacjonarny w 30-60 min (fioletowy).

po stymulacji insuliną receptor insulinowy reaguje szybko fosforylując i uruchamiając kaskadę zdarzeń wzdłuż różnych szlaków. Wzdłuż szlaku PI3K-AKT wszystkie mechanizmy ściśle związane z fosforylacją IRS1 charakteryzują się szybką reakcją. To samo dotyczy innych bezpośrednich celów fosforylowanych IRS1 w Tyr wzdłuż kaskady TSC1/2-mTOR, tj. fosforylacji AMPK przy tworzeniu kompleksów T172, SHP2-IRS1 i GRB2/SOS-IRS1. Szybka reakcja charakteryzuje się albo szybkim wzrostem stanu stacjonarnego, albo przejściowym przekroczeniem, po którym następuje stan stacjonarny, w zależności od braku / obecności mechanizmów sprzężenia zwrotnego działających na cząsteczkę docelową (przypadek 1 i 2, odpowiednio na niebiesko i zielono, na Fig. 3). Mechanizmy stanowiące głównie szlak TSC1 / 2-mTOR i odgrywające rolę w serfosforylacji IRS1 charakteryzują się stosunkowo powolną, nie przekraczającą się odpowiedzią (przypadek 3, Pomarańczowy na Fig. 3). Jak zauważono powyżej, szlak RAS-MAPK zakłada szybką reakcję w komponentach znajdujących się w górnym biegu, która staje się zauważalnie wolniejsza Dla komponentów znajdujących się w dolnym biegu (przypadek 4, Fioletowy na Fig. 3).

ogólnie rzecz biorąc, cząsteczki znajdujące się poniżej szlaku, związane ze stosunkowo powolnymi procesami, takimi jak aktywacja transkrypcji lub interakcja ze środowiskiem poza komórką, takimi jak ERK1/2 i GLUT4, charakteryzują się powolną odpowiedzią, podczas gdy cząsteczki znajdujące się powyżej szlaku charakteryzują się szybką reakcją, tak aby wywołać szybką propagację sygnału. W tym kontekście reakcja przeciążenia, po której następuje powrót do stanu stacjonarnego, może pomóc w osiągnięciu szybkiej propagacji sygnału na jednej trasie sygnałowej, dzięki czemu cząsteczki są ponownie dostępne dla innych tras sygnałowych natychmiast po tym.

przewidywania modelowe w przypadku braku mechanizmów kontrolnych

przeprowadzono następnie szereg symulacji w celu zbadania odporności systemu na dwa docelowe efekty ISP: translokację GLUT4 i fosforylację ERK1/2. W szczególności przeanalizowano rolę dwóch głównych mechanizmów kontroli w regulacji efektów docelowych:

P70S6K – irs1 ujemna pętla sprzężenia zwrotnego (czerwona linia na Rys. 1);
ujemna pętla sprzężenia zwrotnego ERK1 / 2-GRB2 / SOS (Niebieska linia na Rys. 1);

w tym celu porównano przebieg czasowy reakcji GLUT4 i ERK1/2 w obecności i braku wymienionych powyżej dwóch mechanizmów regulacyjnych (Fig. 4). Na dynamikę podwójnie fosforylowanego ERK1/2 silnie wpływają ujemne sprzężenia zwrotne P70S6K-IRS1 i ERK1/2-GRB2 / SOS. Z drugiej strony, na stan stacjonarny i dynamiczne zachowanie GLUT4 w membranie nie ma wpływu ERK1 / 2, ale silnie wpływa ujemna pętla sprzężenia zwrotnego P70S6K-IRS1, potwierdzając tym samym niezwykłe znaczenie tego ostatniego mechanizmu sterującego w określaniu dynamiki systemu.

powszechnie wiadomo, że insulinooporność jest związana z wadami sygnalizacji zależnej od IRS, co implikuje jej rozregulowanie w inicjacji i progresji choroby metabolicznej. Pojawia się pogląd , że pozytywna/negatywna Regulacja IRS przez autologiczne szlaki jest obalana w chorobie przez zwiększone podstawne i inne czasowo nieodpowiednie fosforylacje seryny/treoniny, które prowadzą do zmniejszonego wychwytu glukozy. Hiperinsulinemia kompensacyjna może w tym momencie wzrosnąć i ostatecznie doprowadzić do cukrzycy. Chociaż IRS1 (i IRS2) są regulowane przez złożony mechanizm obejmujący fosforylację ponad 50 różnych reszt seryny/treoniny, w naszym modelu p70s6k-irs1 ujemna pętla sprzężenia zwrotnego wydaje się niezbędna do dobrej kontroli wychwytu glukozy. Wzmocnienie ujemnego sprzężenia zwrotnego P70S6K-IRS1 jest w stanie wyjaśnić zmniejszoną wrażliwość na insulinę i wychwyt glukozy (rys. 5). Podobnie (choć również hipoteza pozytywne sprzężenie zwrotne z mTOR do innej pozostałości seryny IRS1), Brännmark et al. , wykorzystując minimalny model sygnalizacji insulinowej, wykazują, że mechanizm obniżonego dodatniego sprzężenia zwrotnego jest w stanie wyjaśnić zmniejszenie wychwytu glukozy.

z drugiej strony, zarówno pętle ujemnego sprzężenia zwrotnego P70S6K-IRS1, jak i erk1/2-GRB2/SOS wydają się niezbędne do zagwarantowania, że podwójnie fosforylowany ERK wykazuje przejściowe zachowanie, z szczytem w 10 min, po którym następuje powrót do stan wyjściowy. Takie zachowanie było już opisywane w literaturze pod wpływem bodźca insulinowego i pod wpływem bodźca czynnika wzrostu naskórka . Przemijająca odpowiedź ERK zapobiega trwałej aktywacji ERK, która prowadziłaby do ciągłej proliferacji komórek .

Analiza wrażliwości

w celu dalszego zbadania roli dwóch głównych mechanizmów kontrolnych w regulacji efektów docelowych, przeprowadzono lokalną analizę wrażliwości, stosując niewielkie zaburzenia (0.1 % wartości parametru) do jednego parametru modelu na raz i oceny wynikających zmian względnych translokacji GLUT4 i fosforylacji ERK1/2 (patrz metody). W tabelach 1 i 2 przedstawiono współczynniki czułości parametrów modelu, uszeregowane odpowiednio do ich wartości bezwzględnej i porównane z wartością, którą współczynniki przyjmują po usunięciu ujemnych pętli sprzężenia zwrotnego P70S6K-IRS1 i ERK1/2-GRB2/SOS. Współczynniki te mierzą ogólny wpływ, tj. podczas okna obserwacji, zmiany parametru na wynik, tj. odpowiedź GLUT4 i ERK. Wartości dodatnie / ujemne oznaczają, że zwiększenie wartości parametru ma wpływ na zwiększenie / zmniejszenie odpowiedzi. Ponieważ małe wartości bezwzględne oznaczają, że zmiany parametrów nie wpływają znacząco na wynik, w tabelach 1 i 2 podaje się jedynie współczynnik większy niż 0,1 % (wartość bezwzględna), zarówno w modelu oryginalnym, jak i zmodyfikowanym.

Tabela 1 parametryczna analiza wrażliwości pełnego modelu translokacji membrany GLUT4

Tabela 2 parametryczna analiza wrażliwości pełnego modelu aktywacji ERK1/2

parametryczna analiza wrażliwości pełnego modelu odpowiedzi GLUT4 ujawnia, że najbardziej czułe parametry są związane z translokacją GLUT4 do błony plazmatycznej, a następnie te związane z tworzeniem lipidów i tworzeniem/dysocjacją kompleksu IRS1_PI3K. Brak sprzężenia zwrotnego p70S6K_IRS1 ma silny wpływ na zwiększenie czułości (wartości bezwzględnej) parametrów związanych z tworzeniem lipidów i tworzeniem/dysocjacją kompleksu IRS1_PI3K.

parametry związane z początkową fosforylacją/defosforylacją IRS1 w Tyr / Ser mają mniejszą czułość, która zmniejsza się (wartość bezwzględna), ogólnie, poprzez usunięcie sprzężenia zwrotnego P70S6K-IRS1, z wyjątkiem parametru k7p, związanego z fosforylacją IRS1 w Ser. Parametry związane z fosforylacją IRS1 za pośrednictwem PKC w Ser wykazują również zwiększone wartości po usunięciu sprzężenia zwrotnego P70S6K-IRS1. Ponieważ usuwanie sprzężenia zwrotnego ERK1 / 2-GRB2 / SOS nie ma wpływu na translokację GLUT4, współczynniki czułości nie zmieniają się z tym sprzężeniem zwrotnym i bez niego.

Analiza wrażliwości parametrycznej kompletnego modelu odpowiedzi ERK1/2 pokazuje, że najbardziej czułe parametry są związane z aktywacją RAS, MEK i RAF oraz fosforylacją IRS1 w Tyr i Ser, w której pośredniczy p70S6K.zarówno w szlaku PI3K-AKT, jak i w szlaku RAS-ERK1/2, sprzężenie zwrotne ERK1/2-GRB2/SOS wydaje się odgrywać ważną rolę w niezawodności systemu. Na dynamikę systemu słabo wpływa jego brak (patrz Rys. 4), natomiast czułość parametru zwiększa się (w wartości bezwzględnej) w prawie wszystkich przypadkach, jeśli to sprzężenie zwrotne zostanie usunięte.

wnioski dotyczące wpływu sprzężenia zwrotnego P70S6K-IRS1 na odpowiedź ERK1 / 2 są bardziej kontrowersyjne. Usunięcie tego sprzężenia zwrotnego ma wpływ na zmniejszenie czułości parametrów wzdłuż szlaku PI3K_AKT, podczas gdy wzdłuż szlaku RAS-ERK1/2 nie ma prawie żadnego wpływu na parametry związane z fosforylacją mek, inaktywacją RAF i fosforylacją ERK. Zmniejsza wrażliwość na parametry związane z RAS, aktywacją RAF i złożonymi zakłóceniami IRS1-GRB2 / SOS i IRS1-SHP2. Silnie zwiększa czułość parametrów związanych z aktywacją SRC i RAF.

wyniki te podkreślają główną rolę negatywnych pętli sprzężenia zwrotnego w określaniu nie tylko dynamiki systemu biologicznego, ale także jego wytrzymałości. Ta właściwość ma niezwykłe znaczenie, ponieważ zachowuje dynamiczne zachowanie układu przed hałasem i małymi fluktuacjami biologicznymi, Zwykle spowodowanymi zmiennością międzykomórkową.

a rule-based model of insulin signalling pathway