C środki Metylujące
wrażliwość krzyżowa niektórych szczepów bakterii na promieniowanie UV i monofunkcyjny środek alkilujący MMS, w przeciwieństwie do omawianych do tej pory związków, nie wydaje się wynikać z podobnego rozpoznawania uszkodzeń wyeksponowanych przez tę samą endonukleazę, która rozpoznaje dimery tyminowe w DNA. Istnienie mutantów bakteryjnych wrażliwych na MMS jest prima facie dowodem na istnienie mechanizmów naprawczych w typie dzikim, ale teraz wydaje się, że nie jest to alkilowana zasada per se, która jest rozpoznawana przez mechanizm naprawczy, ale prawdopodobnie jednowłóknowa przerwa w DNA. Po leczeniu MMS, B. subtilis został inaktywowany przez tworzenie jednoniciowych przerw w DNA, które, jak wykazano, dziki typ B. subtilis może naprawić (Strauss and Wahl, 1964; Prakash and Strauss, 1970); jednak wrażliwy na MMS mutant miał niedobór lub brak tej zdolności. Ponadto argumentowano, że obserwowana wrażliwość krzyżowa na promieniowanie UV lub rentgenowskie może być spowodowana tworzeniem się przerw jednoniciowych, o których wiadomo, że powstają przez te ostatnie czynniki.
potwierdzenie tego punktu widzenia uzyskano z właściwości mutanta B. subtilis, który był wrażliwy na promieniowanie UV, ale nie na MMS (Searashi i Strauss, 1965). Metylacja zasad DNA, a nie przerwania nici wywołane MMS, nie powoduje żadnej naprawy wycięć w B. subtilis został również wyraźnie wykazany przez brak zaobserwowania jakiejkolwiek znaczącej utraty grup metylowych z DNA komórek dzikiego typu lub wrażliwych podczas kilku pokoleń komórek. To odkrycie wskazywało na zdolność komórek do replikacji metylowanego DNA i jest zgodne z zdolnością replikacyjną DNA zmodyfikowanego przez arylalkilację (Venitt and Asfalty, 1972).
powyższe badanie dotyczące naprawy uszkodzeń metylacji wywołanych MMS w B. subtilis można zatem skontrastować z innymi badaniami nad naprawą uszkodzeń alkilacji wprowadzonymi przez monofunkcyjny środek metylujący MNNG (Lawley and Orr, 1970) w E. coli B/R. różni się on od MMS wytwarzaniem znacznie większego udziału reszt O-6-metyloguaniny w alkilowanym DNA. Ten produkt, jak również 3-metyloadenina i prawdopodobnie niektóre niezidentyfikowane produkty (materiał pochodzenia na chromatogramach papierowych) wydają się być wybiórczo wycięte w porównaniu z utratą N −7-metyloguaniny z DNA komórek B/R E. coli w warunkach umożliwiających zarówno wzrost, jak i syntezę DNA. 3-Metyloadenina I O 6-metyloguanina, ale nie materiał wyjściowy, zostały również wycięte z komórek Bs-1, ale prawdopodobnie w obniżonej cenie. Lawley i Orr nie stwierdzili, czy istnieją jakiekolwiek różnice w przeżywalności komórek B/R leczonych MNNG i BS – 1, które mogłyby wskazywać, że takie różnice w zdolności wycięcia odzwierciedlają działanie mechanizmu naprawy DNA, który pomaga przetrwać komórkom. Jednak Kondo et al. (1970) nie odnotowano zwiększonej śmiertelności lub zwiększonej częstotliwości mutacji w E. coli, dla szczepów niezdolnych do akcyzy dimerów pirymidynowych, po leczeniu MNNG, w porównaniu z MMS. Dzieje się tak pomimo faktu, że alkilowanie DNA przez MNNG wytwarza 20 razy więcej O 6-metyloguaniny niż jest wytwarzane przez alkilowanie DNA przez MMS (Lawley et al., 1971–1972).
dowody na to, że ta” utrata ” 3-metyloadeniny I O-6-metyloguaniny jest spowodowana enzymatycznym mechanizmem wycięcia, innym niż endonukleaza UV, pochodzą z badań in vitro nad właściwościami enzymu, oznaczonego endonukleazą II, wyizolowanego z E. coli (Friedberg and Goldthwait, 1969). Enzym ten jest zdolny do łamania wiązań fosfodiestrowych w DNA, które zostało poddane reakcji ze środkiem alkilującym MMS i rozpoznawania depurynowanych miejsc w DNA. Niedawno wykazano, że uwalnia O 6-metyloguaninę I N 3-metyladeninę, ale nie N 7-metyloguaninę z DNA, które zostało metylowane przez rakotwórczy czynnik MNU (Kirtikar and Goldthwait, 1974). Endonukleaza II posiada zatem wiele różnych funkcji, z których jedna wydaje się zdolna do zerwania wiązań glikozydowych przyłączonych do pewnych podstawionych puryn. Z drugiej strony, może to być mieszanina enzymów. Istnienie enzymu, który jest w podobny sposób zdolny do przeprowadzenia tego postulowanego rozszczepiania wiązań N-glikozydowych (i dlatego nazywany jest N-glikozydazą), zostało niedawno wyizolowane z E. coli i wykazano, że uwalnia wolny uracyl z deaminowanych reszt cytozyny zawierających DNA (Lindahl, 1974). Powstałe w ten sposób miejsce depurynacji może zostać rozpoznane i naprawione przez inny powiązany układ enzymatyczny (por. Verly and Paquette, 1972). Specyficzność preparatu E. coli została również zaobserwowana dla 3-alkiladeniny, ale nie dla 7-alkiladeniny przez Papirmeistera i wsp. (1970). Stwierdzono, że 3-Etyloadenina I O 6 −etyloguanina, ale nie N-7-etyloguanina w DNA powstałym w wyniku reakcji N-etylo-N-nitrozomocznika są podobnie wycięte z DNA WP2 E. coli (Lawley and Warren, 1975). W komórkach ssaków in vivo zaobserwowano wycięcie mniejszych produktów alkilacji puryny, a ponadto zmniejszona zdolność wycięć w niektórych tkankach została skorelowana z tożsamością narządu docelowego dla niektórych rakotwórczych substancji alkilujących (patrz później część B sekcja I, C).
widoczny brak rozpoznawania i wycinania reszt N-7-alkiloguaniny w DNA przez mechanizm naprawczy, na co wskazują badania Prakasha i Straussa (1970) oraz Lawleya i Orra (1970), był również widoczny w badaniach Kimballa i wsp. (1971a) on the effects of MMS and MNNG in Haemophilus influenzae. Jest zatem nieco zaskakujące, że ta sama pozostałość wydaje się być rozpoznawana u Euglena gracilis. Po metylacji N-metylo-N-nitrozo-P-toluenosulfonianem, 7-metyloguanina została utracona z DNA z okresem półtrwania wynoszącym 10 godzin (Olson i McCalla, 1969), który jest znacznie krótszy niż okres półtrwania wynoszący około 5 dni w przypadku spontanicznej hydrolizy przy pH 7,4 w buforze kwasu cytrynowego z fosforanem (Margison i wsp ., 1973). Co więcej, oporny zmutowany szczep najwyraźniej wyciął N-7-metyloguaninę szybciej niż wrażliwy szczep z pojawieniem się mononukleotydów ze zdegradowanego DNA w supernatancie komórkowym (Olson i McCalla, 1969). To nieoczekiwane odkrycie zasługuje zatem na dalsze dochodzenie. Te odkrycia, a następnie, wraz z niewielkim wskaźnikiem szybszej utraty 7-metyloguaniny z DNA wątroby szczura in vivo odnotowane przez Margison et al. (1973), ale nie przez Craddocka (1973a), może sugerować, że ten podstawnik DNA może być rozpoznany przez enzym naprawczy w pewnych okolicznościach.
tabela VI podsumowuje powyższe przykłady utraty produktów chemicznych z DNA bakterii.