czynniki wiążące się z proksymalnym promotorem Pro-COL1A2
w proksymalnym promotorze genu Pro-Col1a2 myszy (154-2350 bp) i sekwencji minimalnej u ludzi pomiędzy 152 a 2378 bp zidentyfikowano kilka funkcjonalnych elementów działających na cis. Pierwszym czynnikiem transkrypcyjnym, który wiązał się z tym promotorem, było wszechobecne białko CBF wiążące CCAAT. Ten czynnik transkrypcyjny tworzy trzy oddzielne podjednostki, nazwane A, B I C, które zostały sklonowane i zsekwencjonowane (Maity and de crombrugghe, 1998). Wszystkie trzy podjednostki są potrzebne, aby CBF wiązało się z sekwencją zawierającą pole CCAAT znajdujące się między 284 a 280 i aktywowało transkrypcję zarówno w genach ludzkich, jak i mysich (patrz Fig. 13.2 B). Dane in vitro sugerują, że podjednostki A I C najpierw łączą się tworząc kompleks A-C, a następnie kompleks ten tworzy cząsteczkę heteromeryczną z podjednostką B(Sinha i in., 1995). Mutacje w pudełku CCAAT, które zapobiegają wiązaniu CBF, zmniejszają aktywność transkrypcyjną proksymalnego promotora Pro-Col1a2 trzy do pięciu razy w przejściowych doświadczeniach transfekcji fibroblastycznych linii komórkowych (Coustry i wsp ., 1995). Oczyszczony CBF, jak również CBF złożony z jego trzech rekombinowanych podjednostek, również aktywują promotor Pro-Col1a2 w bezkomórkowych ekstraktach jądrowych uprzednio zubożonych CBF(Coustry i wsp ., 1995). Dwie z trzech podjednostek CBF zawierają domeny aktywacji transkrypcyjnej. Niedawno pojedyncza substytucja T na A in vivo w obecności wzmacniacza sekwencji ludzkiej w górnym biegu sugerowała, że CBF bierze udział w modelowaniu ekspresji kolagenu typu I w osi grzbietowo-Środkowej, a także w osi rostrokaudalnej fibroblastów skóry myszy (Tanaka i in., 2004).
oprócz miejsca wiązania CBF, eksperymenty footprinting i badania przesunięcia żelu zidentyfikowały inne miejsca wiązania w pierwszych 350 bp promotora Pro-Col1a2 myszy. Wykazano, że trzy sekwencje bogate w GC, zlokalizowane przy około 2160 bp (między 2176 a 2152 bp) i 2120 bp (między 2131 a 2114 bp) wchodzą w interakcje z białkami wiążącymi DNA w wyniku eksperymentów śladowych i testów przesunięcia żelu (Hasegawa i wsp., 1996). Delecja w promotorze myszy obejmująca te trzy sekwencje footprinted całkowicie zniosła aktywność transkrypcyjną proksymalnego promotora Pro-Col1a2 w przejściowych doświadczeniach transfekcji z wykorzystaniem fibroblastycznych linii komórkowych. Odpowiednie regiony w ludzkim promotorze Pro-COL1A2 były również chronione w doświadczeniach in vivo i in vitro (Ihn et al., 1996) i związanych z nim aktywatorów transkrypcyjnych. Jednak testy przesunięcia żelu przeprowadzone przy użyciu ludzkiego promotora Pro-COL1A2 sugerują, że element działający na cis znajdujący się przy 2160 bp reprezentuje element represora (Ihn et al., 1996), sugerując, że interakcje między białkami oddziałującymi z aktywatorami o bp 2300, bp 2125 i bp i białkami wiążącymi się z elementem represorującym o bp 2160 regulują ten gen. Niedawno wykazano, że CUX1, białko wypierania CCAAT, jest związane ze zmniejszoną ekspresją kolagenu typu i zarówno In vivo, jak i in vitro oraz że wzmocnienie ekspresji CUX1 powoduje skuteczną supresję kolagenu typu i poprzez zakłócanie wiązania CBF (Fragiadaki i wsp., 2011).
wykazano, że Sp1 i Sp3 wiążą motyw TCCTCC znajdujący się między 2123 a 2128 bp; oba czynniki transkrypcyjne aktywują ten promotor (Ihn et al., 2001) (patrz Rys. 13.2 B). Ponadto, białka, które wiążą się z dwoma segmentami proksymalnymi, wiążą się również z najbardziej zaawansowanym segmentem bogatym w GC, przy 2300 bp, z wyjątkiem CBF, co sugeruje redundancję wśród funkcjonalnie aktywnych segmentów DNA proksymalnego promotora Pro-COL1A2.
TGFß pośredniczy w jego działaniu w ludzkim promotorze poprzez połączenie wszechobecnego czynnika transkrypcyjnego Sp1, kompleksu Smad3/4 i białka wiążącego koaktywatory p300/CREB (CBP) w czymś, co nazywa się elementem reagującym na tgfß (Tßre) (Zhang i wsp., 2000). Segment ten zawiera trzy motywy bogate w GC między 2330 a 2255, zdolne do wiązania Sp1, białka wiążącego CCAAT/wzmacniacz (C/EBP), białka aktywatora 1 (AP1) i kompleksów Smad (Chen i wsp., 1999, 2000A, B; Kanamaru et al., 2003; Tamaki et al., 1995; Zhang et al., 2000). Interakcja między tymi czynnikami jądrowymi jest synergiczna i wymaga wiązania Sp1 i Smad3 / 4 odpowiednio z elementami bogatymi w GC i miejscem niższego rzędu SMAD CAGAC (Ghosh et al., 2000; Poncelet and Schnaper, 2001; Zhang et al., 2000). Na przełomie tego stulecia toczyła się wielka debata nad tym, czy Smady są ważniejsze od AP1 w proksymalnym promotorze. Zostało to rozwiązane około 10 lat później, kiedy wykazano, że TGFß aktywuje również gen COL1A2 za pośrednictwem niekanonicznego (niezależnego od Smad) szlaku sygnałowego, który wymaga współpracy wzmacniacza/promotora obejmującej wymianę C-Jun/JunB czynnika transkrypcyjnego zajęcia krytycznego miejsca wzmacniacza, co skutkuje stabilizacją koalescencji wzmacniacza/promotora (Ponticos et al., 2009). Raport badający wpływ niedotlenienia i TGFß na gen COL1A2 dodał do potencjalnej roli Smads, w szczególności Smad3, w regulacji ekspresji kolagenu. Badania te na ludzkich komórkach mezangialnych sugerują, że w warunkach niedotlenienia i w obecności tgfß indukowany hipoksją czynnik 1α (HIF-1α)i Smad3 mogą tworzyć kompleksy transkrypcyjne i preferencyjnie wzmacniać wiązanie z jednym z trzech elementów odpowiedzi hipoksji w ludzkim promotorze COL1A2 w pozycji -335 bp (Baumann i wsp ., 2016). Autorzy sugerują, że ta nowatorska interakcja zapewnia mechanizm, który odpowiada za synergię obserwowaną między HIF i TGFß w zwłóknieniu nerek.
TNFa i interferon-γ (IFN-γ) hamują wytwarzanie matrycy. W przeciwieństwie do pojedynczego elementu DNA, który pośredniczy w stymulacji tgfß proksymalnego promotora col1a2, wykazano, że zarówno TNFa, jak i IFN-γ hamują transkrypcję COL1A2 poprzez zakłócanie tworzenia kompleksu indukowanego tgfß oraz poprzez stymulowanie interakcji czynników negatywnych z reagującymi elementami DNA znajdującymi się w jego 5′ i 3′. Ten tak zwany „element reagujący na cytokiny” odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy. Udział AP1 i NF-kB w transdukcji hamującego działania TNFa na ekspresję genu COL1A2 wykazano przy użyciu nieśmiertelnych fibroblastów od myszy, które nie posiadają aktywatora AP1 Jun N-końcowej kinazy 1 (JNK1) lub NF-kB niezbędnego modulatora NEMO. W szczególności, utrata JNK1 zapobiegała antagonizmowi TNFa wobec Tgfß, ale zachowała hamowanie TNFa konstytutywnej ekspresji COL1A2. Antagonizm Tgfß przez TNFa polega na fosforylacji c-jun JNK1, co prowadzi do konkurencji off-DNA tej ostatniej cząsteczki dla wiązania Smad3 z poznanym miejscem DNA i / lub interakcji z koaktywatorami p300 / CBP(Kouba i wsp ., 1999; Verrecchia et al., 2001, 2002).
Wiązanie IFN-γ z jego receptorami prowadzi do fosforylacji tyrozynowej kinazy janusowej (JAK) kinaz tyrozynowych, co z kolei powoduje przetwornik sygnału i aktywator fosforylacji transkrypcji (STAT1). W COL1A2 aktywacja STAT1 skutkuje konkurencją z Smad3 o interakcję z p300/CBP (Inagaki et al., 2003). Ponadto JAK1 może również aktywować czynnik transkrypcyjny y-box binding factor( YB-1); aktywacja ta powoduje zarówno hamowanie konstytutywnej aktywności promotora poprzez wiązanie YB-1 Z pudełkiem 2125tc, jak i antagonizm sygnałów TGFß poprzez konkurencję Yb-1 z Smad3 i/lub p300/CBP (Ghosh i wsp., 2001; Higashi et al., 2003). Aby uzyskać więcej informacji, zobacz „czynniki wzrostu”i” cytokiny.”
Wykazano również, że Est1/Fli1 wiążą tę samą sekwencję z odwrotnym wpływem na transkrypcję kolagenu typu I. Funkcjonalny czynnik transkrypcyjny Ets zidentyfikowano w COL1A2 w pobliżu miejsc Sp1. Ets1 stymulował, natomiast Fli1 hamował aktywność promotora. Wiązanie Sp1 było niezbędne do hamowania Fli1. Ponadto nadekspresja Fli1 w fibroblastach skórnych doprowadziła do obniżenia poziomu mRNA COL1A2 i białka (Czuwara-Ladykowska i in., 2001). Ponadto leczenie tgfß fibroblastów skórnych prowadzi do dysocjacji Ets1 z kompleksów CBP/p300 i zmienia ich odpowiedź na tgfß na rzecz degradacji macierzy (Czuwara-Ladykowska i in., 2002).
ponadto wykazano, że motyw CpG przy 17 bp jest preferencyjnie metylowany i wiązany przez białka RFX w komórkach nabywających kolagen i-ujemny stan. Eksperymenty z transfekcją komórek w połączeniu z testami wiązania DNA przypisały pozytywne lub negatywne właściwości każdemu z białek wiążących się z proksymalnym promotorem Pro-COL1A2 (Sengupta i in., 2002). Z drugiej strony wykazano, że stopień metylacji w miejscu 17 CpG moduluje powinowactwo wiązania białek RFX i, w konsekwencji, ich zdolność do zmniejszania aktywności promotora poprzez rekrutację powiązanych białek, które zakłócają montaż pozytywnie działających kompleksów transkrypcyjnych (Xu i in., 2003, 2004).