Dwuwymiarowa elektroforeza żelu poliakrylamidowego (strona 2D): postępy i perspektywy

wprowadzenie

ostatnie 25 lat, a zwłaszcza ostatnia dekada, było świadkami zwiększonego wysiłku w celu opracowania technologii zdolnych do identyfikacji i ilościowego oznaczania dużej liczby białek wyrażanych w systemie komórkowym (tj.. Złożoność proteomu sprawiła, że opracowywanie metod skutecznej separacji i czułego wykrywania białek stało się krytycznym składnikiem tego wysiłku. Dalsze postępy w technologii spektrometrii masowej (MS) umożliwiły wykrywanie białek ze znacznie większą szybkością i czułością niż wcześniej możliwe. Jednak nawet najnowocześniejsze MS nie jest w stanie scharakteryzować wszystkich składników w złożonym proteomie. Naukowcy przyjmują podejście „dziel i rządź” do charakteryzowania proteomów, ponieważ próbują tymczasowo ograniczyć liczbę białek, które spektrometr masowy ma analizować. Poprzez rozprzestrzenianie się proteome, więcej proteiny ostatecznie analizować w ramach indywidualnego eksperymentu.

aby oddzielić proteomy, naukowcy zastosowali technologie elektroforetyczne i chromatograficzne, oddzielnie i w połączeniu, zarówno offline, jak i online. Chociaż te wysiłki mogą prowadzić do oddzielenia i identyfikacji tysięcy białek, żadna pojedyncza metoda nie może rozwiązać wszystkich białek w proteomie, ze względu na ich dużą liczbę i zakres dynamiki stężenia. Separacje jednowymiarowe są niewystarczające do skutecznego rozdzielania złożonych mieszanin białkowych. Fakt ten został potwierdzony ponad pół wieku temu przez Smithies i Poulik (1), którzy uznali, że połączenie dwóch procesów elektroforetycznych na żelu pod kątem prostym powinno dać znacznie większy stopień rozdzielczości niż jest to możliwe w przypadku obu osobno. Dwa procesy elektroforetyczne są rozdzielane przez wielkość cząsteczkową i mobilność wolnego roztworu na żelu skrobiowym. Ich przewidywania nadal się sprawdzają i stały się podstawą do opracowania ortogonalnych wielowymiarowych metod rozdzielania złożonych mieszanin nie tylko za pomocą elektroforezy żelowej, ale także za pomocą chromatografii i elektroforezy kapilarnej.

aby właściwie zrozumieć postępy poczynione w dwuwymiarowej stronie (2D-PAGE), trzeba cofnąć się znacznie dalej niż ćwierć wieku. W 1930 roku tiselius wprowadził metodę moving boundary jako narzędzie analityczne do badania elektroforezy białek (2). Od czasu jego pionierskich prac, różne formy elektroforezy zostały wykorzystane do oddzielania złożonych mieszanin białek, z których każda ma lepszą rozdzielczość. Już w 1962 r.Raymond i Aurell (3) wykazali znaczący nieliniowy wpływ stężenia żelu na mobilność elektroforetyczną białek poprzez zastosowanie elektroforezy 2-D przy użyciu różnych stężeń żelu akryloamidowego w celu oddzielenia białek surowicy. Dwa lata później Raymond (4) wykazał wyższość żeli płaskich w porównaniu z cylindrycznymi żelami rurowymi. Na przykład płaska płyta zapewnia maksymalną powierzchnię do chłodzenia żelu; otrzymane wzory są łatwiejsze do określenia w standardowych densytometrach rejestrujących; duża liczba próbek może być przetwarzana za pomocą pojedynczej płytki żelowej, co ułatwia bezpośrednie porównanie próbek przetwarzanych w identycznych warunkach; i, co najważniejsze, płaska płyta umożliwia zastosowanie separacji 2-D. Te wnikliwe preferencje okazały się prawdziwe i są dziś praktykowane w wielu laboratoriach bioanalitycznych.

kolejny postęp w separacji żelu 2-D został wprowadzony w 1972 r. przez Wrighta (5), który użył kolumny poliakryloamidowej o stężeniu 4,75% (2%) w pierwszym wymiarze, którą następnie usunięto ze szklanego cylindra i położono na górnej krawędzi płyty o gradiencie 2%. Po elektroforezie, płytkę żelową umieszczono w roztworze barwienia, w wyniku czego uzyskano wizualizację 112 rozdzielonych białek surowicy ludzkiej.

te nowatorskie podejścia rozwiązywały tylko niewielką liczbę białek, przede wszystkim najbardziej obfite białka komórki lub proteomu surowicy. Wprowadzenie 2D-PAGE w 1975 przez O ’ Farrella (6) do oddzielania białek komórkowych w Warunkach denaturacji umożliwiło rozdzielczość setek białek. Zastosowana zasada była bardzo prosta: białka rozdzielano na żelu za pomocą ogniskowania izoelektrycznego (IEF), który oddziela białka w pierwszym wymiarze zgodnie z ich punktem izoelektrycznym, a następnie elektroforezy w drugim wymiarze w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS), który oddziela białka zgodnie z ich masą molekularną. Metoda O ’ Farrella jest naprawdę podstawą nowoczesnej strony 2D, która została szybko zaadaptowana i powszechnie zaakceptowana przez innych badaczy. Anderson i Anderson (7) wykorzystali 2D-PAGE do analizy ludzkich białek osocza. Byli w stanie oddzielić i wykryć około 300 różnych plam białkowych po barwieniu. W przeciwieństwie do O ’ Farrella, Manabe (8) oddzielał ludzkie białka osocza za pomocą 2D-PAGE bez środków denaturujących. Na żelu można było zaobserwować około 230 plam białkowych; jednak plamy były rozmazane i nie były dobrze rozwiązane.

wprowadzenie unieruchomionych gradientów pH

jak wspomniano powyżej, 2D-PAGE zawiera IEF w pierwszym wymiarze, a następnie SDS-PAGE w drugim wymiarze. Od czasu wprowadzenia przez Kolina w 1954 r. (9) IEF przeszedł kilka postępów. Pierwszy wymiar przeprowadza się w prętach z żelu poliakrylamidowego, które są formowane w szklanych lub plastikowych rurkach i zawierają amfolity, które tworzą gradient pH w polu elektrycznym. Pręty te były historycznie nieodwracalne, niestabilne i trudne do pracy. Wprowadzenie immobilized pH gradients (IPGs) przez Bjellqvist et al. (10) miał znaczący wpływ na zastosowanie IEF do oddzielania złożonych mieszanin w szerokim zakresie pH. IPGs umożliwiło tworzenie stabilnych i powtarzalnych gradientów pH zdolnych do skupienia kwaśnych i zasadowych białek na pojedynczym żelu przygotowanym z szerokimi gradientami pH. W IPGs amfolity nośnikowe są przyłączane do cząsteczek akrylamidu i odlewane do żeli w celu utworzenia stałego gradientu pH. Mocowanie gradientu zapobiega dryfowaniu w żelu, a także zapewnia, że można je odlewać w sposób wydajny i powtarzalny. Zastosowanie pasków IPG o wąskim zakresie pozwoliło na oddzielenie większej liczby białek niż było to możliwe w przypadku standardowego 2D-PAGE, Ponieważ węższy zakres pH był rozłożony na większą odległość fizyczną. Ten rozprzestrzenianie pozwalać proteiny z podobny izoelektryczny punkt (pI) wartość rozdzielać z wyższa rozdzielczość. Aby zilustrować ten punkt, Hoving et al. opracowali metodę 2D-PAGE, w której zastosowali wąskie paski IPG w pierwszym wymiarze (11). Paski IPG miały zwykle 1-3 pH U szerokości i pokrywały się ze sobą o co najmniej 0,5 pH U. zastosowano sześć pasków IPG obejmujących zakres pH od 3,5 do 10. Białka z linii komórkowej chłoniaka typu B nanoszono na każdy pasek i rozdzielano za pomocą IEF. Każdy pasek nanoszono następnie na pojedynczą płytkę żelową SDS-PAGE, a białka oddzielono w drugim wymiarze na podstawie ich masy cząsteczkowej. Przy użyciu sześciu pasków IPG wykryto około 5000 wyraźnych plamek, w porównaniu z 1500 plamkami wykrytymi przy użyciu pojedynczego paska IPG o zakresie pH 3-10 i jednej standardowej 2D-stronicowej płytki żelowej. Wildgruber et al. (12) porównano stosowanie 3 pasków IPG o zakresie pH 4-5, 5-6 i 5,5–6,7 z żelami z paskami IPG o zakresie gradientu pH 3-10 i 4-7. Byli w stanie wykryć 2,3 i 1,6× więcej plam białkowych przy użyciu trzech wąskich pasm IPG niż z dwoma szerszymi pasmami IPG (odpowiednio 3-10 i 4-7).

podczas gdy wyższa rozdzielczość uzyskiwana przy użyciu wielu nakładających się wąskich IPG umożliwia identyfikację większej liczby białek, każdy wąski pasek wymaga oddzielnej płytki żelowej i pewnej ilości tej samej próbki do załadowania na każdy. Wymóg ten oznacza, że jeżeli objętość lub stężenie próbki są ograniczone, takie doświadczenie może nie być możliwe. W przypadku ograniczonych próbek należy rozważyć szerszy zakres pH lub minimalną liczbę IPG.

dwuwymiarowa różnicowa elektroforeza w żelu (2D-DIGE)

cel oddzielania białek za pomocą 2D-PAGE jest dwojaki: (i) identyfikacja nowych białek oraz (ii) pomiar ich względnej obfitości między próbkami porównawczymi. Jedną z zalet 2D-PAGE jako techniki rozdzielania jest to, że nie tylko rozwiązuje dużą liczbę białek,ale barwienie tych białek umożliwia określenie względnej obfitości białek. Na przykład białka wyekstrahowane z dwóch próbek surowicy (zdrowe i chore) są ładowane na oddzielną płytkę żelową. Po barwieniu plamy białkowe są wyrównywane i skanowane w celu zmierzenia ich indywidualnej intensywności. Chociaż dokonano wielu postępów w zakresie narzędzi do ustawiania oprogramowania,trudno było zapewnić bezpośrednie porównanie między dwoma oddzielnymi żelami. Opracowanie 2-D różnicowej elektroforezy w żelu (DIGE) w 1997 r.przezwyciężyło to ograniczenie, umożliwiając rozdzielenie do trzech różnych mieszanin białek w jednym żelu 2D-PAGE (13). W typowym eksperymencie 2D-DIGE, białka wyekstrahowane z trzech różnych próbek, zdrowe, chore, i kontroli wewnętrznej (zbiorcza próbka utworzona z mieszania równych ilości białek wyekstrahowanych z zdrowych i chorych próbek), są kowalencyjnie oznakowane, każdy z cyjaniny fluorescencyjny barwnik, który ma inną długość fali wzbudzenia i emisji. Próbki są migracji dopasowane, tak, że to samo białko oznakowane którymkolwiek z barwników będzie migrować do tej samej pozycji na żelu. Użyte barwniki cyjaninowe to: 1-(5-karboksy-pentylo)-1′ – propylookarbacianina halogenek estru N-hydroksysukcynimidylowego (Cy3); 1-(5-karboksypentylo)-1′-metyloindodikarbacianina halogenek estru N-hydroksysukcynimidylowego(Cy5); i 3-(4-karboksymetylo)fenylometylo-3′ – etyloksakarbacianina halogenek estru N-hydroksysukcynimidylowego (CY2). Równe stężenia różnie znakowanych białek i próbki kontrolnej są mieszane, osadzane na jednej płytce żelowej i rozdzielane za pomocą strony 2D. Próbka kontrolna służy jako wewnętrzny standard, zapewniając zgodność zarówno między żelem, jak i wewnątrz niego. Próbka kontrolna powinna zawierać każde białko obecne we wszystkich próbkach w eksperymencie. Oznacza to, że każde białko w eksperymencie ma unikalny sygnał w standardzie wewnętrznym, który jest używany do bezpośrednich porównań ilościowych w każdym żelu i normalizacji ilościowych wartości obfitości dla każdego białka między żelami. Skanowanie żelu przy określonych długościach fal wzbudzenia każdego barwnika, przy użyciu imagera fluorescencyjnego, umożliwia wizualizację różnicowo znakowanych białek (ryc. 1). Obrazy są następnie scalane i analizowane za pomocą oprogramowania do obrazowania, które umożliwia porównanie różnic między poziomami obfitości białek. Wartość w DIGE eliminuje wszelkie błędy związane z niewspółosiowością żelu i zapewnia dokładną ocenę ilościową (14).

białka będące przedmiotem zainteresowania są usuwane z żelu, proteolitycznie trawione i identyfikowane za pomocą SM. Ponieważ jest on wykonywany przy użyciu pojedynczej płytki żelowej, 2D-DIGE wymaga 50% mniej żeli, co czyni go bardziej ekonomicznym i różnice w ekspresji białka między dwoma różnymi próbkami białek łatwiejsze do porównania i dokładniej zobrazowane. Ponadto potrzeba mniej czasu na wykrycie plam białkowych, ponieważ reakcja znakowania w DIGE jest szybsza niż wizualizacja przy użyciu metod barwienia. Gdy istnieje potrzeba porównania poziomów ekspresji białka w dwóch różnych próbkach, DIGE jest metodą z wyboru (15).

mocne i słabe strony strony 2D

elektroforeza jest ustaloną techniką, która przeszła kilka postępów, które poprawiły rozdzielczość, wykrywanie, oznaczanie ilościowe i odtwarzalność. Podejścia 2-D SDS-PAGE i 2D-DIGE do profilowania białek są dostępnymi i ekonomicznymi metodami, które mają wysoką rozdzielczość i umożliwiają wykrywanie setek białek na pojedynczej płytce żelowej. Chociaż odtwarzalność była problemem z 2D-PAGE, zwłaszcza podczas profilowania dwóch mieszanin białek, została znacznie ulepszona przy użyciu 2D-DIGE. Rozdzielczość została zwiększona przez wprowadzenie IPGs, które umożliwiają analitykowi dostosowanie gradientu pH do maksymalnej rozdzielczości przy użyciu żeli ultrazoom o wąskim zakresie gradientu pH. Z nowoczesnym 2D-PAGE, nie jest niczym niezwykłym, aby rozwiązać dwa białka, które różnią się pI o 0,001 U.

chociaż 2D-PAGE został ograniczony przez jego niezdolność do rozwiązywania białek, które są zbyt zasadowe lub zbyt kwaśne, zbyt duże lub zbyt małe, ograniczenie to stale maleje. Na przykład separację białek zasadowych można analizować za pomocą IPGs w zakresie pH 4-12. Nauka o separacji zawsze ewoluuje i nie minie długo, zanim pozostałe kwestie elektroforezy żelowej zostaną odpowiednio rozwiązane.

wprowadzenie 2D-DIGE ogromnie przyczyniło się do rozwiązania problemów odtwarzalności i ilościowości. Wykorzystanie imagerów i komputerów umożliwia nie tylko szybkie eksplorację danych, akwizycję i analizę, ale także wykrywanie miejsc, normalizację, profilowanie białek, korekcję tła oraz raportowanie i eksportowanie danych. Jako technika separacji, wykrywania i ilościowej, 2D-DIGE jest ważnym narzędziem, zwłaszcza w laboratoriach klinicznych zaangażowanych w określanie poziomów ekspresji białek i odkrycie biomarkera choroby. Gdy absolutna biologiczna zmienność między próbkami jest głównym celem, jak w biomarker odkrycie, 2D-DIGE jest metodą wyboru.

chociaż nastąpił znaczny postęp w nongel (lub rozwiązanie oparte) metody łączenia metod frakcjonowania bezpośrednio online z analizy MS, 2D-PAGE pozostał popularną techniką prowadzenia badań proteomicznych. Chociaż 2D-PAGE, jak każdy schemat frakcjonowania, ma swoje zalety i wady, nie ma wątpliwości, że pozostanie niezbędną techniką charakteryzacji proteomów przez wiele nadchodzących lat.