Streszczenie
Ligustrum vicaryi L. jest hybrydą Ligustrum ovalifolium Hassk. var. aureo-marginatum i Ligustrum vulgale L., należący do rodziny Oleowatych („Oleaceae”). Jest często używany jako ozdobny krzew ze względu na złote liście. Jednak jego wartość medyczna nie została jeszcze odkryta. Ostatnio polisacharydy roślinne przyciągnęły kompleksową uwagę ze względu na ich właściwości biologiczne, w tym działanie immunomodulujące i przeciwutleniające. Badanie to miało na celu wyodrębnienie, oczyszczenie i scharakteryzowanie polisacharydu z owoców Ligustrum vicaryi L. oraz zbadanie jego aktywności immunomodulującej i przeciwutleniającej. Polisacharyd owocowy Ligustrum vicaryi L. (LVFP) uzyskano przez ekstrakcję ultradźwiękową, wytrącanie etanolu, separację żywic makroporowych i oczyszczanie worka dializowego. Właściwości fizykochemiczne LVFP zostały wyjaśnione za pomocą spektrometrii w podczerwieni z transformacją Fouriera, wysokosprawnej chromatografii jonowej i wysokosprawnej chromatografii filtracyjnej w żelu. Wyniki wykazały, że LVFP składał się z ramnozy, arabinozy, galaktozy i glukozy w stosunku 1,79 : 7,55 : 4,58 : 1,54, a jego masa cząsteczkowa wynosiła 88 949 Da. Działanie immunomodulujące i przeciwutleniające LVFP badano na mysim modelu immunosupresyjnym indukowanym cyklofosfamidem (Cy -). Wyniki wykazały, że lvfp znacząco zwiększyło indeksy śledziony i grasicy, zwiększyło funkcję fagocytarną neutrofilów, aktywowanych limfocytów B I T oraz zwiększyło stężenie IL-10 i TNF-α w surowicy. Ponadto zaobserwowaliśmy, że LVFP łagodzi uszkodzenia wątroby wywołane Cy poprzez zwiększenie poziomów dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i peroksydazy glutationowej (GSH-px). Wyniki te sugerują, że LVFP ma działanie immunomodulujące i przeciwutleniające, dlatego kładzie podwaliny pod zastosowanie LVFP w przemyśle farmaceutycznym i żywności funkcjonalnej.
1. Wprowadzenie
immunomodulatory mogą być stosowane jako strategie zapobiegawcze lub terapeutyczne, wzmacniające lub tłumiące odpowiedź obronną gospodarza. Naturalne produkty o funkcjach immunomodulujących i przeciwutleniających są szeroko stosowane w leczeniu kilku chorób, w tym chorób autoimmunologicznych, zaburzeń zapalnych i raka . Ostatnio wzrosło zainteresowanie niedrogimi i mniej toksycznymi produktami naturalnymi nad stosowaniem syntetycznych chemioterapeutyków.
Ligustrum vicaryi L. jest hybrydą Ligustrum ovalifolium Hassk. var. aureo-marginatum i Ligustrum vulgale L., należący do rodziny Oleowatych („Oleaceae”). Wykazuje fenotyp bez chlorofilu i jest szeroko stosowany jako krzew Ogrodniczy ze względu na złote liście. Zgodnie z charakterystyką wymiany gazowej i reakcjami fluorescencji chlorofilu, Ligustrum vicaryi L. może być odporny na SO2, a tym samym może być stosowany do fitostabilizacji gleby zanieczyszczonej Cd . Chociaż Ligustrum vicaryi L. ma wysoką wartość ozdobną i ochronę środowiska, jego potencjał terapeutyczny nie został jeszcze wyjaśniony.
polisacharydy roślinne, Klasa ważnych makrocząsteczek biologicznych powszechnie występujących w tradycyjnych ziołach leczniczych, wykazują szereg działań biologicznych, w tym działanie przeciwutleniające, immunomodulujące, przeciwstarzeniowe, przeciwnowotworowe i przeciwzapalne . W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań poświęconych ekstrakcji i analizie bioaktywności polisacharydów roślinnych. Polisacharydy z owoców roślinnych są najczęściej badane, w tym polisacharydy jujube , polisacharydy persimmon i polisacharydy arbuza . Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą nie zgłoszono badania opartego na przygotowaniu i bioaktywności polisacharydów owocowych Ligustrum vicaryi L. (LVFPs).
w tym badaniu lvfp ekstrahowano i oczyszczano. Następnie analizowano masę cząsteczkową i skład monosacharydowy LVFP. Ponadto, funkcje biologiczne LVFP oceniano w mysim modelu immunosupresyjnym indukowanym cyklofosfamidem (Cy -). Wyniki wykazały, że LVFP ma zdolność immunomodulującą poprzez aktywację zarówno odporności wrodzonej, jak i adaptacyjnej. Ponadto lvfp wykazał aktywność przeciwutleniającą poprzez zwiększenie dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i peroksydazy glutationowej (GSH-px). Badanie to przedstawiło teoretyczne podstawy do opracowania LVFP jako alternatywnego środka terapeutycznego w chorobach odpornościowych.
2. Materiały i metody
2.1. Dobrostan zwierząt i oświadczenia etyczne
wszystkie procedury eksperymentalne były zgodne z zaleceniami wytycznych ARRIVE (animal research: reporting in vivo experiments). Institutional Animal Care and Use Committee of Jining Medical University zatwierdził procedury. Wszystkie eksperymentalne procedury przeprowadzono tak humanitarnie, jak to tylko możliwe. Łącznie 100 zdrowych samców myszy Kunming o wadze 20-25 g trzymano w Warunkach utrzymujących 12 godzin sztucznego cyklu ciemnego światła, z pożywieniem i wodą dostępną ad libitum. Zwierzęta trzymano w standardowych pomieszczeniach dla zwierząt, o temperaturze 20-22°C i wilgotności 55-60%.
2.2. Ekstrakcja i oczyszczanie polisacharydów
Ligustrum vicaryi L. owoce zostały uzyskane z ogrodu botanicznego Uniwersytetu Medycznego w Jining (Rizhao, Shandong, Chiny) i zidentyfikowane przez Jianan Wang (Botanik Medyczny, School of Pharmacy, Jining Medical University). Suszone owoce Ligustrum vicaryi L. sproszkowano i przesiewano przez sito o oczkach 40. Proszek zanurzono w acetonie (stosunek proszku do acetonu wynosił 1: 3) i wstrząsano przez 24 godziny w celu usunięcia lipidów. Supernatant odrzucono, a resztki wysuszono w piecu. Polisacharyd ekstrahowano wodą destylowaną 8: 1 (v/w) w temperaturze 50°C przez 80 minut przy użyciu mocy ultradźwiękowej 250 W. Ekstrakt wody filtrowano przy użyciu bawełny. Pozostałość usunięto po odwirowaniu przy 3000 obr. / min przez 3 min. Następnie stężony supernatant wytrącono 70% etanolem, a proces ten powtórzono 95% etanolem. Po usunięciu supernatantu dodano wodę destylowaną w celu rozpuszczenia ekstraktu, a pozostałość usunięto przez odwirowanie. Do usunięcia pigmentu użyto żywicy makroporowej DM101. Odczynnik Sevage (chloroform / 1-butanol, v/V = 4 : 1)użyto do usunięcia białka, dopóki nie zaobserwowano reakcji przebarwienia przy użyciu detekcji Coomassie Brilliant Blue G-250. Polisacharydy umieszczono w zamrażarce na 24 godziny w celu uzyskania zamrożonego proszku. Małe cząsteczki polisacharydu usuwano za pomocą worka do dializy (odcięcie cząsteczkowe 3500 Da) przez dwa dni, a wodę destylowaną wymieniano co 12 godzin. do oczyszczania lvfp zastosowano chromatografię Kolumnową Sephadex G-200. Do określenia czystości LVFP wykorzystano test antronowo-siarkowy z krzywą wzorcową glukozy.
2.3. Analiza podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)
LVFP miesza się z czystym proszkiem bromku potasu, a mieszaninę umieszcza się w moździerzu agatowym i równomiernie szlifuje pod lampą podczerwieni. Mieszaninę oceniano za pomocą spektrometru podczerwieni z transformacją Fouriera IRTracer-100 (Shimadzu, Japonia).
2.4. Wysokosprawna chromatografia jonowa (HPIC)
do analizy HPIC, 5 mg LVFP rozpuszczono w 1 mL 2 mol/L kwasu trifluorooctowego i umieszczono w temperaturze 121°C przez 2 godziny w celu hydrolizy. Następnie mieszaninę przesączono za pomocą mikroporowatej membrany filtracyjnej o średnicy 0,45 µm. Chromatograficzną separację monosacharydów przeprowadzono na chromatografie jonowym ICS-5000 wyposażonym w kolumnę CarboPac PA20 i detektor amperów impulsowych. Warunki rozdzielania chromatografii jonowej dostosowano i przebadano dla mieszaniny ośmiu wzorców monosacharydów (fukozy, ramnozy, arabinozy, galaktozy, glukozy, ksylozy, mannozy i fruktozy). Lepszą separację uzyskano przez elucję gradientową o stałym natężeniu przepływu 0,5 mL / min. Faza ruchoma składała się z 250 mM NaOH (a), wody (zawierającej 1 m NaAc%, v/v, B) i wody (C). Elucję przeprowadzono w następujący sposób: 2.0% a przy 0 ~ 21 min; 2,0% A i 5,0% B przy 21,1 min; 2,0% A i 20% B przy 21,1 ~ 30 min; i 80% a przy 30,1 ~ 50 min.
2.5. Wysokowydajna żelowa chromatografia filtracyjna (HPGFC)
Masa cząsteczkowa polisacharydu została przeanalizowana przez Hpgfc (Waters, Nowy Jork, USA) i wyposażona w rid (detektor współczynnika załamania światła 2414) i stację roboczą Empower 3. Warunki chromatograficzne były następujące: kolumna chromatograficzna: Ultrahydrogel ™ Linear, 300 mm × 7,8 mm × 2, faza ruchoma: 0,1 m NaNO3, natężenie przepływu: 0,9 mL/min i temperatura kolumny: 45°C. Próbkę rozpuszczono w fazie ciekłej i przesączono mikroporowatą membraną filtracyjną. Wzorcami masy cząsteczkowej stosowanymi do krzywej kalibracyjnej były MW135350, mw36800, mw9750, mw2700 i mw180.
2.6. Indukowany cyklofosfamidem (Cy-) model immunosupresyjny myszy i podawanie LVFP
łącznie 100 myszy podzielono losowo na pięć grup: kontrolną, Cy, Cy + LVFP (100 mg/kg/dobę), Cy + LVFP (200 mg/kg/dobę) i Cy + LVFP (400 mg/kg/dobę). Grupie kontrolnej podawano prawidłowy roztwór soli fizjologicznej, a pozostałym czterem grupom podawano dootrzewnowo Cy (40 mg/kg) codziennie przez siedem dni. LVFP podawano przez siedem kolejnych dni.
2.7. Oznaczanie wskaźników śledziony i grasicy
wszystkie myszy ważono i poświęcano 24 godziny po ostatnim podaniu leku. Śledzionę i grasicę wycięto i zważono. Wskaźnik śledziony lub grasicy wyrażono jako stosunek masy śledziony lub grasicy do masy ciała.
2.8. Do oceny fagocytozy neutrofilów wykorzystano oznaczenie funkcji fagocytarnej mysich neutrofilów
Staphylococcus aureus. Krótko mówiąc, 40 µL krwi uzyskano od myszy po podaniu LVFP i umieszczono w probówce heparyny, aby zapobiec koagulacji. Następnie do wyżej wspomnianej probówki dodano 40 µL zawiesiny bakteryjnej. Mieszaninę równomiernie powlekano na szkiełkach szklanych i utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 0,5 godziny. następnie mieszaninę utrwalano 2-3 kroplami metanolu przez 5 minut i barwiono 4-5 kroplami plamy Wrighta przez 5 minut. Łącznie zaobserwowano i zarejestrowano 100 neutrofili. Wskaźnik fagocytarny neutrofili i wskaźnik fagocytarny neutrofili obliczono w następujący sposób: wskaźnik fagocytarny neutrofili = liczba neutrofili wykazujących funkcję fagocytarną/całkowita liczba neutrofili i wskaźnik fagocytarny neutrofili = całkowita liczba bakterii, które zostały pochłonięte przez neutrofile/całkowita liczba neutrofili.
2.9. Oznaczanie hemolizyny w surowicy metodą ELISA
czwartego dnia 5% zawiesiny krwinek czerwonych z kurczaka (CRBC) wstrzyknięto dootrzewnowo myszom (0,1 mL/10 g). Siódmego Dnia, 2 godziny po podaniu LVFP, uzyskano 1 mL krwi myszy i odwirowano przez 10 minut. Następnie do 2 mL soli fizjologicznej dodano 40 µL surowicy. Do surowicy dodano jeden mL 10% surowicy świnki morskiej i 1 mL 5% zawiesiny CRBC, a następnie inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 0,5 godziny. mieszaninę odwirowywano i supernatant umieszczano w 96-studzienkowej płytce hodowlanej. Odpowiednia wartość gęstości optycznej została wykryta przez Thermo Scientific Multiskan MK3 Enzyme Mark instrument (Waltham, MA, USA).
2.10. Oznaczanie szybkości transformacji limfocytów T
drugiego dnia myszy wstrzyknięto domięśniowo fitohemaglutyninę (PHA) w dawce 8 mg/kg. Siódmego Dnia, 2 godziny po podaniu LVFP, pobrano 40 µL krwi z zatoki retroorbitalnej, umieszczono na szkiełku i poplamiono 4-5 kroplami plamy Wrighta. Nadmiar barwnika przepłukano wodą po 20 min. Przy użyciu mikroskopu zaobserwowano 100 komórek. Transformowane limfocyty obliczono w następujący sposób: szybkość transformacji limfocytów = transformowane limfocyty/całkowita liczba limfocytów.
2.11. Odpowiedź nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH)
odpowiedź DTH oceniano na podstawie stopnia obrzęku ucha. Ogólnie rzecz biorąc, uważa się, że stopień obrzęku ucha odzwierciedla stopień zapalenia . Odpowiedź DTH oceniano następująco: drugiego dnia usunięto 1 cm2 owłosienia brzucha za pomocą Na2S, a skórę brzucha pokryto 25 µL roztworu 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenu (DNFB). Szóstego dnia skórę prawego ucha pokryto 20 µL roztworu DNFB. Siódmego Dnia, 2 godziny po podaniu LVFP, myszy poświęcono, wycięto i zważono dwa uszy. Różnica wagi między dwoma uszami determinowała stopień obrzęku ucha.
2.12. Wykrywanie cytokin TNF-α i IL-10 w surowicy
Siódmego Dnia, 2 godziny po podaniu LVFP, krew myszy uzyskano za pomocą nakłucia zatok retroorbitalnych i naturalnie koagulowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie krew odwirowywano przez 20 minut i pobierano supernatant. TNF-α i IL-10 w supernatancie wykryto za pomocą zestawów ELISA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chiny).
2.13. Wykrywanie poziomów dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GSH-Px) i aldehydu dikarboksylowego metanu (MDA)
ósmego dnia myszy poświęcono i ekstrahowano wątroby. Po zmieleniu i odwirowaniu supernatant tkanki wątroby zebrano w celu wykrycia SOD, GSH-px i MDA. SOD, GSH-px i MDA mierzono za pomocą zestawów ELISA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chiny).
2.14. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE)
barwienie HE przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami . Ósmego dnia myszy poświęcono, a tkanki wątroby ekstrahowano i utrwalano w 10% obojętnej buforowanej formalinie. Po osadzeniu w parafinie tkanki pocięto na odcinki 5 µm. Następnie szkiełka zostały zabarwione HE w celu określenia zmian morfologicznych. Zdjęcia były fotografowane pod mikroskopem świetlnym (Olympus, Tokio, Japonia).
2.15. Analiza statystyczna
osoby/preparaty doświadczalne przydzielono losowo do grup i uzyskano równe wielkości grup. Zadania grupowe, rejestracja danych i analiza danych nie zostały ujawnione badaczowi. Dane są pokazane jako średnia ± SD z co najmniej pięciu niezależnych eksperymentów. Jednokierunkowa ANOVA wraz z testem wielokrotnych porównań Tukeya została wykorzystana do wielokrotnych porównań przy użyciu GraphPad Prism w wersji 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) i została uznana za statystycznie istotną.
3. Wyniki
3.1. Analiza spektrum FTIR LVFP
LVFP ekstrahowano przez usunięcie lipidów za pomocą acetonu, gorącej wody w połączeniu z ekstrakcją ultradźwiękową, wytrącaniem etanolu, usuwaniem pigmentu za pomocą żywicy makroporowej, deproteinacją za pomocą odczynnika Sevage i usuwaniem małych cząsteczek za pomocą worka do dializy. Ponadto nowa struktura polisacharydów charakteryzowała się spektroskopią w podczerwieni. Analizę widma FTIR dla LVFP przedstawiono na rysunku 1 (a). Charakterystyczny szeroki szczyt na 3345 cm−1 odpowiadał wibracjom rozciągającym O-H (być może w tym N-H). Szczyt absorpcji przy 2929 cm-1 odpowiadał szczytowi absorpcji drgań rozciągających C-H I szczytowi absorpcji cukru. Absorpcja przy 1599 cm-1 wskazywała na tryby drgań zginających-OH. Szczyt na 1412 cm-1 wynikał z obecności drgań zginających C-H. Ponadto absorpcja przy 1073 cm-1 wskazywała na zginanie wibracji rozciągania C-O W alkoholowej formie grupy hydroksylowej.
3.2. Skład monosacharydowy LVFP
kompozycje monosacharydowe LVFP analizowano za pomocą HPIC. Jak pokazano na fig. 1 (b) i 1(c), wszystkie monosacharydy istniejące w polisacharydach zidentyfikowano zgodnie z czasem elucji wzorców monosacharydowych, w odniesieniu do krzywej standardowej. Lvfp składał się głównie z ramnozy, arabinozy, galaktozy i glukozy w stosunku molowym 1,79 : 7,55 : 4,58 : 1,54.
3.3. Oznaczanie masy cząsteczkowej LVFP przez HPGFC
Masa cząsteczkowa LVFP została wykryta przez HPGFC. Dekstrans (Masa cząsteczkowa: 180, 2700, 9750, 368000 i 135350 Da) były stosowane jako normy, ponieważ są rozpuszczalne w wodzie i dostępne w szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Normy te zawierały wytyczne dotyczące szacowania wielkości LVFP. Uzyskano krzywą standardową (y = -0,523 x + 13,01, R2 = 0,995). Wyniki wykazały, że masa cząsteczkowa LVFP wynosiła 88 949 Da.
3.4. Wpływ LVFP na indeksy grasicy i śledziony u myszy immunosupresyjnych indukowanych Cy
w celu zbadania aktywności immunomodulującej LVFP ustalono model myszy immunosupresyjnej indukowanej Cy. Cy podawano we wstrzyknięciu dootrzewnowym (40 mg/kg mc.) codziennie przez siedem dni. Po pięciu dniach podawania Cy myszy wykazywały objawy, takie jak wypadanie włosów, niskie podniecenie, agresja, słaby apetyt i utrata masy ciała, podczas gdy w grupie kontrolnej nie zaobserwowano wyraźnych zmian, co wskazuje, że model zwierzęcy został pomyślnie ustalony. Grupy Cy + LVFP otrzymywały różne stężenia LVFP (100, 200 i 400 mg/kg mc./dobę) przez siedem kolejnych dni. Indeksy śledziony i grasicy odzwierciedlają funkcje odpornościowe organizmu . Wpływ LVFP na indeksy grasicy i śledziony u myszy immunosupresyjnych indukowanych Cy przedstawiono na fig.2. W porównaniu z grupą kontrolną, Grupa Cy wykazała znaczny spadek wskaźników grasicy i śledziony. Podawanie LVFP znacząco zwiększało te wskaźniki w sposób zależny od dawki. Wyniki te sugerowały, że LVFP może wpływać na narządy odpornościowe w celu zwiększenia odporności.
(a)
(b)
(a)
(b)
3.5. Wpływ LVFP na fagocytozę neutrofilów u myszy immunosupresyjnych indukowanych Cy
neutrofile są skuteczną obroną przed inwazją mikroorganizmów . Fagocytoza jest kluczową strategią dla neutrofili w zabijaniu patogenów . W celu zbadania aktywacji neutrofilów badano wskaźnik fagocytarny i wskaźnik fagocytarny . Jak pokazano na fig. 3, w porównaniu z grupą kontrolną, Grupa Cy miała znacząco zmniejszoną częstość występowania fagocytozy i indeks fagocytarny, co wskazuje na stan immunosupresyjny. Podawanie LVFP (200 mg/kg mc. i 400 mg/kg mc.) znacznie złagodziło te zmiany. Wyniki te sugerują, że LVFP może zwiększyć funkcję fagocytarną neutrofilów.
(a)
(b)
a)
(b))
3.6. Wpływ LVFP na odporność humoralną i odporność komórkową u myszy immunosupresyjnych indukowanych Cy
odporność humoralna ma kluczowe znaczenie dla organizmu w walce z nowotworami i infekcjami. Poziom hemolizyny w surowicy można wykorzystać do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej . Hemolizyna w surowicy została zmniejszona w wyniku leczenia Cy, a zmiana ta została znacząco osłabiona przez LVFP w sposób zależny od dawki(Fig. 4 (A)). Różne antygeny z krwi mogą aktywować limfocyty T. PHA może działać jako mitogen, aby wywołać aktywację i proliferację komórek T. Test transformacji limfocytów T przeprowadzono przy użyciu krwi myszy po stymulacji PHA w obecności lub bez LVFP. Jak pokazano na fig. 4 (b), wszystkie trzy dawki LVFP znacząco hamowały indukowaną Cy redukcję szybkości transformacji limfocytów T. Odpowiedź DTH jest odpowiedzią immunologiczną zależną od komórek T. Odpowiedź DTH oceniano mierząc stopień obrzęku ucha. Wszystkie trzy dawki LVFP wyraźnie atenuowały indukowane Cy zahamowanie w stopniu obrzęku ucha (Fig. 4 (c)). Wyniki te sugerowały, że LVFP może aktywować limfocyty B I T.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.7. Wpływ LVFP na ekspresję IL – 10 i TNF-α w surowicy myszy immunosupresyjnych indukowanych przez Cy
cytokiny wydzielane przez komórki odpornościowe odgrywają istotną rolę w obronie gospodarza . IL-10 i TNF-α są kluczowymi mediatorami zapalnymi . Przeprowadzono test ELISA w celu ustalenia wpływu LVFP na ekspresję il-10 i TNF-α w surowicy. Nasze wyniki wykazały, że ekspresja IL-10 i TNF-α po leczeniu Cy była znacznie zmniejszona. Podawanie LVFP w zależności od dawki zwiększało poziomy IL-10 i TNF-α (rycina 5).
(a)
(b)
(a)
(b))
3.8. Wpływ LVFP na stres oksydacyjny u myszy immunosupresyjnych indukowanych Cy
ponadto w tym badaniu zbadano, czy lvfp łagodzi stres oksydacyjny wywołany Cy i uszkodzenie wątroby. SOD przekształca anion ponadtlenkowy w H2O2 i O2, aby zapobiec i zneutralizować uszkodzenia wywołane przez wolne rodniki . GSH-px uważa się za ważną endogenną obronę przed peroksydacyjnym zniszczeniem błony komórkowej . MDA jest produktem końcowym peroksydacji lipidów i może odzwierciedlać uszkodzenie oksydacyjne w tkance wątroby . Fig. 6 (a) -6 (c) pokazują znacznie zmniejszoną ekspresję SOD i GSH-px, ze zwiększonym poziomem MDA w tkance wątroby po leczeniu Cy. Podawanie lvfp w zależności od dawki zwiększało poziomy SOD i GSH-px oraz zmniejszało poziom MDA. Następnie zmiany w morfologii wątroby oceniano za pomocą barwienia HE. Jak pokazano na fig. 6 (d), w grupie Cy komórki wątroby były rzadkie i nieuporządkowane wraz z jądrem pyknotycznym. Zatoki wątrobowe były pełne czerwonych krwinek. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki wątroby w grupie LVFP ułożono w sposób uporządkowany z wyraźnym jąderkiem, porównywalny do tych w grupie kontrolnej. Wyniki wskazywały, że LVFP może złagodzić stres oksydacyjny i uszkodzenie wątroby wywołane przez Cy.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
4. Dyskusja
w tym badaniu ekstrahowano polisacharyd z owoców Ligustrum vicaryi L. i oceniano jego działanie immunomodulujące i przeciwutleniające. Polisacharyd ekstrahowano gorącą wodą w połączeniu z ekstrakcją ultradźwiękową, wytrącaniem etanolu,usuwaniem tłuszczu acetonem, usuwaniem pigmentu żywicą makroporową DM101, deproteinacją odczynnikiem Sevage (chloroform/1-butanol, v/V = 4 : 1) i usuwaniem małych cząsteczek za pomocą worka do dializy. Co więcej, ta struktura polisacharydów charakteryzowała się spektroskopią w podczerwieni, HPGFC-RID i HPIC. Wyniki wykazały, że masa cząsteczkowa LVFP wynosi 88,949 Da, a LVFP składa się z czterech monosacharydów, a mianowicie ramnozy, arabinozy, galaktozy i glukozy w stosunku molowym 1,79 : 7,55 : 4,58 : 1,54.
immunosupresja jest stanem tymczasowej lub trwałej dysfunkcji immunologicznej i może uczynić organizm bardziej wrażliwym na patogeny. Opracowanie nowych środków immunomodulujących jest jedną z najskuteczniejszych metod zapobiegania i leczenia chorób immunosupresyjnych . Na przykład środki immunomodulujące w połączeniu z lekami chemioterapeutycznymi wydają się być przydatne w terapii nowotworów. Kilka doniesień wskazuje na dodatnią korelację między działaniem immunomodulującym a polisacharydami. Ayeka et al. wykazano, że lukrecja (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) polisacharyd ma działanie immunomodulujące widoczne poprzez aktywację populacji komórek immunologicznych CD4+ i CD8+ oraz zwiększoną produkcję różnych cytokin, takich jak IL-2, IL-6 i IL-7 . Chen et al. izolowane polisacharydy z Schisandra sphenanthera i Schisandra chinensis; ekstrakty te mogą zwiększyć aktywność fagocytarną makrofagów i poprawić odporność organizmu . Podobno zaobserwowano, że polisacharydy z Schisandra sphenanthera i Schisandra chinensis składały się głównie z arabinozy, glukozy i galaktozy, podobnie jak skład LVFP. Aby zbadać, czy LVFP posiada funkcje immunomodulujące, stworzono mysi model immunosupresji indukowanej Cyjanem. Cy jest chemioterapeutykiem i był stosowany do tworzenia immunosupresyjnych modeli zwierzęcych . Na poziomie narządów immunologicznych wyniki wskazywały, że LVFP znacząco zwiększyło wskaźniki śledziony i grasicy u myszy immunosupresyjnych indukowanych Cy. Na poziomie komórek immunologicznych zaobserwowano, że LVFP wzmacnia funkcję fagocytarną neutrofilów i promuje aktywację limfocytów B I T. Dane te wskazują, że LVFP może wzmacniać zarówno odporność wrodzoną, jak i adaptacyjną.
ponadto badano także cytokiny immunologiczne w surowicy, a wyniki wykazały, że LVFP zwiększało poziomy IL – 10 i TNF-α. Podobno kilka rodzajów polisacharydów może wpływać na ekspresję czynników zapalnych. Chen et al. zaobserwowano, że siarczanowane polisacharydy z mikroalg nitkowatych Tribonema Sp. może zwiększać ekspresję IL-6, IL-10 i TNF-α w makrofagach . Cheng et al. poinformował, że polisacharydy z Dzikiego Lactarius deliciosus zwiększają wydzielanie TNF-α, IL-1β i IL-6 w makrofagach . Wang et al. poinformował, że polisacharyd z porostu Umbilicaria esculenta indukuje uwalnianie TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6 i IL-10 w mysich makrofagach .
przeciwutleniacze są substancjami, które hamują utlenianie w organizmie człowieka. Zwykle istnieje równowaga między reaktywną produkcją tlenu a systemem obrony przeciwutleniającej, który jest niezbędny w normalnym metabolizmie. Komórki wytwarzają niektóre endogenne przeciwutleniacze, takie jak SOD i GSH-px, aby stłumić nadmierne wolne rodniki . W badaniu tym określono aktywność przeciwutleniającą LVFP u myszy immunosupresyjnych indukowanych Cy. Wyniki wykazały, że LVFP wykazywał znaczny wzrost ekspresji SOD i GSH-px. Ponadto LVFP zmniejszało ekspresję MDA, co wskazuje na uszkodzenie oksydacyjne w wątrobie. Barwienie wykazało, że LVFP może złagodzić uszkodzenie komórek wątroby wywołane przez Cy. Można zatem stwierdzić, że LVFP może chronić komórki przed uszkodzeniem wywołanym stresem oksydacyjnym poprzez zwiększenie produkcji przeciwutleniaczy, takich jak SOD i GSH-px. Wcześniejsze badania wykazały, że zawartość ramnozy, arabinozy i galaktozy w kompozycji monosacharydów może wpływać na aktywność przeciwutleniającą . Zawartość ramnozy, arabinozy i galaktozy w LVFP jest wyższa, co może być ważne dla silniejszej aktywności przeciwutleniającej wykazanej przez LVFP.
ogólnie ekstrahowano polisacharydy z owoców Ligustrum vicaryi L. i badano ich właściwości fizyczne i biologiczne. LVFP może być badany jako potencjalny środek immunomodulujący i przeciwutleniający do stosowania terapeutycznego w chorobach immunosupresyjnych, umożliwiając wprowadzenie tradycyjnej medycyny chińskiej na rynek międzynarodowy.
5. Wnioski
podsumowując, LVFP ekstrahowano i oczyszczano z owoców Ligustrum vicaryi L. o masie cząsteczkowej 88,949 Da i składały się z czterech monosacharydów, a mianowicie ramnozy, arabinozy, galaktozy i glukozy. Wstępne badania farmakologiczne wykazały, że LVFP może skutecznie poprawić funkcje odpornościowe i wykazuje aktywność przeciwutleniającą. Badanie to pokazuje, że LVFP może być obiecującym środkiem immunomodulującym i przeciwutleniającym w terapiach farmaceutycznych (rycina 7).
dostępność danych
dane TIF użyte do potwierdzenia wyników tego badania są dostępne u odpowiedniego autora na żądanie.
konflikty interesów
autorzy oświadczają, że nie ma konfliktów interesów dotyczących publikacji niniejszego artykułu.
podziękowania
ta praca była wspierana przez National Natural Science Foundation Of China (81800399), Jining Medical University Doctoral Research Startup Fund, Fundusz na rzecz innowacji i przedsiębiorczości studentów na poziomie krajowym (201610443011), Shandong Traditional Chinese Medicine Science and Technology Development Program (2019-0450) oraz Jining Medical University Student Innovation Training Program (2019-0450).cx2016011/cx2019092).