A rule-based model of insulina signaling pathway

the model of insulina signaling pathway

Starting from three published models, we implemented the model of ISP as represented in Fig. 1 using the Systems Biology Graphical Notation .

o modelo da via de sinalização da insulina. O modelo da Via sinalizadora de insulina obtido integrando a via PI3K-AKT, a via mTOR e a via RAS-MAPK, representado usando a notação gráfica de biologia de Sistemas. Os nós coloridos assemelham-se aos resultados de agrupamento obtidos em perfis simulados (ver Fig. 3 ). As linhas coloridas representam mecanismos de feedback importantes, nomeadamente:: a linha a vermelho representa a P70S6K-IRS1 ciclo de feedback negativo, a linha azul a ERK1/2-GRB2/SOS ciclo de feedback negativo

O modelo é constituído por muitos elementos responsáveis pela acção da insulina desde os três principais sub-caminhos do ISP, brevemente descritos a seguir, estão incluídos.

a via PI3K-AKT

para a via PI3K-Akt, referimo-nos principalmente ao modelo em Sedaghat et al. . O modelo tem sido usado por vários grupos de pesquisa e inclui muitos dos componentes de sinalização mais conhecidos mediando a translocação do GLUT4 transportador de glicose. Estes incluem a insulina de ligação do receptor e reciclar os subsistemas; o pós-receptor de sinalização do subsistema, incluindo tanto Ser – e Tyr – fosforilação do insulin receptor substrate1 (IRS1); a formação de um complexo (IRS1_PI3K complexa) entre fosforilada IRS1 e phosphatidylinositide 3-quinase (PI3K); o phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphates PI(3,4,5)P3, síntese; a fosforilação da proteína cinase B (AKT) e da proteína cinase c (PKC)-ζ; a translocação do GLUT4 para a membrana plasmática. Os efeitos da proteína tirosina fosfatase (PTP1B) e das fosfatases lipídicas (SHIP2 e PTEN) também são considerados no modelo.

a via TSC1 / 2-mTOR

para a via TSC1 / 2-mTOR referimo-nos principalmente ao modelo recentemente publicado em Sonntag et al. , descrevendo o efeito do mTOR em resposta à insulina e aos aminoácidos. O modelo considera ambos os complexos mTOR: mTORC1 e mTORC2. a activação do mtroc1 depende da presença de aminoácidos e é inibida pela activação das proteínas 1 e 2 (TSC1/2) da esclerose tuberosa (isto é, fosforilação do Ser), que, por sua vez, depende da activação da proteína cinase activada pelo AMP (AMPK) de 5′. A activação do AMPK depende da fosforilação do Irs1 Tyr, enquanto a inibição do TSC1/2 (isto é, fosforilação do Tyr) depende da fosforilação do AKT em Thr309. mTORC2, que foi recentemente identificado como a desconhecida proteína cinase 2 (PDK2) dependente da fosfoinositida. a cinase responsável pela fosforilação de SER474 da AKT contribui para a fosforilação dupla da AKT juntamente com a fosforilação de Thr309, operada pela proteína cinase 1 dependente da fosfoinositida (PDK1). Sonntag et al. formule a hipótese da presença de uma variante PI3K, que é diretamente regulada pelo receptor de insulina ativada e, por sua vez, ativa o mTORC2. Incluímos esta hipótese em nosso modelo.

a via RAS-MAPK

para a via RAS-MAPK, referimo-nos principalmente ao modelo em Borisov et al. , que descreve tanto o FEG como os estímulos de insulina. O modelo inclui todos os principais mecanismos químicos envolvidos na RAS-MAPK caminho: a interação de Tyr fosforilada IRS1 com SHP2 (o domínio SH2-contém proteína tirosina quinase 2) e GRB2-SOS complexo (o receptor de fator de crescimento vinculado a 2 e o filho de sevenless complexo), formando, assim, o SHP2-IRS1 e GRB2/SOS-IRS1 complexos, respectivamente; o GTP – binding de RAS; a fosforilação da RAF proto-oncogene serina/treonina proteína quinase c-RAF); a interação da insulina receptor com o Ras GTPase ativação de proteína (RASGAP), que por sua vez, catalisa o processo inverso de Ras desativação; a ativação do proto-oncogene tirosina da proteína quinase SRC que totalmente ativa c-RAF; a dupla especificidade do agente mitogénico-activated kinase 1/2 (MEK1/2); extracelular-sinal-regulado cinases (ERK1/2).

integração das vias PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR e RAS-MAPK

as vias PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR e RAS-MAPK contêm várias partes sobrepostas, as quais, nos artigos originais, foram muitas vezes modeladas de formas diferentes, baseando-se em pressupostos ligeiramente diferentes. Comparamos as reações sobrepostas em diferentes modelos e implementamos a versão mais atualizada deles com base no conhecimento atual da bioquímica celular. Além disso, a integração dos três modelos necessários para lidar com as diferentes unidades de medição adotadas para descrever as variáveis de Estado. Enquanto os experimentos com imunoblot permitem obter informações importantes sobre a escala de tempo dos eventos de sinalização, informações quantitativas sobre a expressão proteica são muitas vezes problemáticas para recuperar de modo que os perfis de concentração previstos são por vezes relatados na concentração micromolar, como em Borisov et al. , ou em unidades arbitrárias (AU), como em Sonntag et al. . Em contraste, em Sedaghat et al. , a concentração foi expressa em unidades molares ou em percentagem da concentração total (por exemplo, a concentração de citosol de GLUT4 foi considerada como sendo 96% da concentração total de GLUT4 na célula no estado inicial).

potencialmente, a Mae permite realizar simulações determinísticas e estocásticas, desde que as quantidades das variáveis sejam expressas em cópias de moléculas por célula. Mesmo se no presente trabalho não usamos simulação estocástica, alinhamos todas as variáveis para a mesma unidade, i.e. número de moléculas por célula, multiplicando as unidades molares por NA*V (na indica número de Avogadro e V o volume celular, considerado igual a 3e-12 l). Todos os detalhes sobre a conversão de unidades a partir de AU e concentrações percentuais são indicados em materiais e métodos.

o modelo resultante consiste em 42 regras de reação e 101 parâmetros que codificam as interações entre 61 espécies químicas distintas. As reações, os valores dos parâmetros e as condições iniciais são todos relatados no arquivo adicional 1.

novidades do modelo RBM-ISP

a implementação do RBM, facilitou a contabilização de uma série de características do ISP, tais como a fosforilação de proteínas de sinalização em múltiplos locais e com efeitos múltiplos, a interação simultânea de moléculas com diferentes parceiros de ligação e a localização subcelular de algumas reações. As características acima listadas são discutidas em detalhes no seguinte.

fosforilação de proteínas de sinalização em múltiplos locais

as moléculas de sinalização podem ter níveis de actividade diferentes, dependendo dos resíduos que são fosforilados. Considere, por exemplo, IRS1 e AKT. O IRS1 tem muitos resíduos potencialmente envolvidos em modificações pós-translacionais e pode ser activado ou inibido na sua acção cinase, dependendo do resíduo fosforilado ser Tyr ou Ser . Por exemplo, a fosforilação Tyr-896 é necessária para a ligação PI3K, SHP2 e GRB2, enquanto a fosforilação Ser-636 por p70S6K é um mecanismo relacionado com a resistência à insulina . AKT, em contraste, pode ser ativado por fosforilação em Thr309 ou Ser474 por PDK1 e mTORC2, respectivamente .

IRS1 a inibição/activação dependente da fosforilação já estava incluída no modelo Sedeghat, embora considerando a fosforilação ser regulada pela PKC e não pela p70S6K, como no modelo Sonntag. Aqui nós modelamos as ações PKC e p70S6K e descrevemos pIRS1-Tyr896 formação complexa / dissociação com PI3K, SHP2 e GRB2 .

os dois locais de fosforilação da AKT não foram explicitamente modelados em Sedaghat et al. . Nós modelamos a fosforilação AKT em Thr mediada por PI (3,4,5)P3 como em Sedaghat et al. model and the AKT phosphorylation at Ser mediated by mtroc2 as in Sonntag et al. modelo e assumiu:

1. i)

   AKT fosforilada, quer ao Thr ou ambos os sites para agir em TSC1/2 complexo, ao mediar a sua fosforilação em Tyr e dephosphorylation a Ser ;

2. ii)

   fosforilação da AKT em Serviços ou ambos os sites para inativar C-RAF ;

3. iii)

   fosforilação da AKT em ambas Thr ou Serviços para activar a translocação de GLUT4 .

a interacção com múltiplos parceiros de ligação

a interacção das moléculas nas vias de sinalização com numerosos parceiros de ligação diferentes resulta na formação potencial de complexos diferentes. No ISP, o IRS1 fosforilado em Tyr-896 pode ligar-se ao PI3K tal como modelado em Sedaghat et al. ou GRB2 / SOS e SHP2, conforme modelo em Borisov et al. . A fim de corresponder a especificação do modelo RBM-ISP com o conhecimento atual, permitimos a formação de complexos diferentes. Thus, IRS1 can bind in a Mutual exclusive way GRB2 / SOS and SHP2, but can bind simultaneously GRB2 / SOS and the p85 regulatory subunit of PI3K .

informação sobre a localização subcelular nas regras de reacção

a possibilidade de as proteínas terem de interagir está frequentemente relacionada com a sua localização física, ou seja, a sua presença no espaço extra-celular, citoplasma, núcleo, membrana plasmática, etc. Por exemplo, os lípidos PI (3,4,5)P3 funcionam como locais de acoplagem de membrana plasmática que recrutam diferentes proteínas contendo domínios de homologia da pleckstrina (PH) (e.g. AKT e PDK1) e sua co-localização podem acelerar eventos de sinalização específicos . Outro exemplo é a interação do mtroc1 com o homólogo Ras enriquecido no cérebro (RHEB) e a família Rag na membrana lisossoma, relatada por Zoncu et al. . Em nosso modelo, incluímos a informação sobre a localização subcelular para o receptor de insulina e o transportador GLUT4, distinguindo entre sua localização plasmática e citoplasmática de acordo com a descrição matemática dada por Sedaghat et al. .

previsões do modelo

os perfis de concentração de todas as espécies químicas que populavam o modelo foram simulados com 60 min, 100 nM de estimulação da insulina. A concentração de 100 nM representa um nível bem aceito de estimulação da insulina em culturas celulares comumente encontrado na literatura e usado também pelo nosso grupo . De acordo com Sonntag et al. , nós também assumimos uma estimulação constante de aminoácidos, necessária para obter a ativação mTORC1 e o feedback de p70S6K sobre IRS1. Para avaliar a fiabilidade do modelo, as previsões do modelo foram comparadas com os dados experimentais disponíveis no nosso conjunto de dados para algumas fosfoproteínas no tempo 2, 5, 10, 30 e 60 minutos após a insulina e aminoácidos, ou seja, a leucina, estimulação . Como mostrado na Fig. 2, os perfis experimentais e previstos de pAKT-S473 e pmTORC1-S2448 estão de acordo, uma vez que ambos mostram um aumento do padrão de fosforilação atingindo um estado estacionário nos primeiros 2-5 min e 20-30 min, respectivamente. O perfil previsto para ppERK1/2-Y202,Y204 é confirmado por dados experimentais nos primeiros 10 minutos, enquanto nos últimos pontos diminui rapidamente nos dados experimentais em relação às previsões do modelo. O perfil observado em dados experimentais para ppERK1/2-Y202,Y204, pode ser mais bem ajustados, aumentando a força do feedback entre ppERK1/2-Y202,Y204 e GRB2/SOS. Em Fig. 2 (Painel superior direito, linha pontilhada), é apresentado o perfil simulado de ppERK1/2-Y202, Y204 obtido multiplicando o parâmetro kcat39 (ver ficheiro adicional 1) por um factor de 10. Note – se que no modelo ISP RBM disponível online, decidimos deixar o parâmetro do modelo inalterado, ou seja , usamos o valor da literatura, adiando a otimização de parâmetros para estudos futuros, quando mais dados estarão disponíveis. Infelizmente, os dados experimentais de pP70S6K-T389 não eram confiáveis (apenas um replicado disponível), então não podemos comparar os perfis experimentais e simulados para esta proteína, que é um endpoint da via com uma ação de feedback importante no IRS1. No entanto,o perfil simulado apresentado na Fig. 2 (Painel inferior, direito) assemelha-se a dados experimentais apresentados em outros trabalhos .

comparação entre dados simulados e dados experimentais. Comparison between experimental concentration (points) and normalized model predictions (lines) for pAkt-S473, ppERK1/2, pmTOR-S2448 and pP70S6K-T389. O perfil de ppERK1/2-Y202,Y204 obtido aumentando a resistência do feedback entre ERK e GRB2/SOS é mostrado em linhas pontilhadas. São notificados valores para dados experimentais de células do músculo esquelético humano (SkMCs) expostas ao EBSS + 100 nM de insulina no momento 0′, 2′, 5′, 10′, 30′, e 60′. Todas as medições foram feitas em três replicados biológicos, e para cada replicado biológico, três medições técnicas replicadas foram feitas. Todos os dados são expressos em unidades arbitrárias (UA) e rescaled entre 0 e 1 para efeitos de comparação

Nós examinados, a previsão de perfis de todos os ativos de espécies e agrupou-os em quatro grupos de acordo com o seu comportamento dinâmico, como mostrado na Fig. 3:

Agrupamento de perfis simulados. Foram identificados quatro aglomerados para os perfis previstos da espécie ativa, de acordo com o seu comportamento dinâmico: 1) resposta Rápida, atingindo o estado estacionário dentro de 2-5 min (azul); 2) Rápido ultrapassagem respostas atingindo um pico dentro de 2-5 min e descendente, para um estado de equilíbrio após 10-20 min (verde); 3) resposta Lenta, atingindo o estado estacionário em 10-20 min (laranja); 4) Lento ultrapassagem respostas atingindo um pico entre 5 e 10 minutos e decrescente para um estado estável, em 30 a 60 min (roxo)

1. resposta Rápida, atingindo o estado estacionário dentro de 2-5 min (azul)

2. Rápido a ultrapassagem de resposta, atingindo o pico dentro de 2-5 min e, em seguida, o estado estacionário depois de 10-20 min (verde)

3. resposta Lenta, atingindo o estado estacionário em 10-20 min (laranja)

4. Lenta ultrapassagem respostas, atingindo o pico em 5 a 10 min e o estado estacionário, em 30 a 60 min (roxo).

após a estimulação da insulina, o receptor de insulina responde rapidamente pela fosforilação e desencadeia uma cascata de eventos ao longo de vias distintas. Ao longo da via PI3K-AKT, todos os mecanismos estreitamente relacionados com a fosforilação Tyr – Irs1 são caracterizados por uma resposta rápida. O mesmo se aplica a outros alvos diretos do IRS1 fosforilado em Tyr ao longo da cascata de tsc1/2-mTOR, ou seja, fosforilação de AMPK em T172, SHP2-IRS1 e formação de complexos GRB2/SOS-IRS1. A resposta rápida é caracterizada por uma rápida ascensão para o estado estacionário, ou por um transitório overshoot seguido pelo estado estacionário, a condição, dependendo da ausência/presença de mecanismos de feedback, agindo sobre a molécula-alvo (caso 1 e 2, em azul e verde, respectivamente, nas Fig. 3). Os mecanismos que constituem principalmente a via TSC1 / 2-mTOR e desempenham um papel na Ser-fosforilação da IRS1 são caracterizados por uma resposta não-ofuscante relativamente lenta(caso 3, laranja na Fig. 3). Como observado acima, a via RAS-MAPK assume nos seus componentes a montante uma resposta rápida, que se torna visivelmente mais lenta nos componentes a jusante (caso 4, púrpura na Fig. 3).Em geral, moléculas a jusante da via, relacionadas com processos relativamente lentos como a ativação da transcrição ou a interação com o ambiente fora da célula, como ERK1/2 e GLUT4, são caracterizadas por uma resposta lenta enquanto moléculas a montante da Via são caracterizadas por uma resposta rápida de modo a provocar uma rápida propagação do sinal. Neste contexto, a resposta de superação seguida pelo regresso a um estado estacionário poderá ajudar a alcançar uma rápida propagação de sinais numa via de sinalização, tornando as moléculas novamente disponíveis para outras vias de sinalização imediatamente a seguir.

previsões do modelo na ausência de mecanismos de controle

um número de simulações foram então realizadas para investigar a robustez do sistema em dois efeitos alvo do ISP: translocação GLUT4 e fosforilação ERK1/2. Em especial, analisou-se o papel de dois importantes mecanismos de controlo na regulação dos efeitos-alvo.:

• p70s6k-IRS1 feedback negativo loop(linha vermelha na Fig. 1);

• ciclo de realimentação negativa ERK1/2-GRB2/SOS (linha azul na Fig. 1);

para este efeito, comparou-se o tempo de resposta GLUT4 e ERK1/2 na presença e ausência dos dois mecanismos regulamentares acima enumerados (Fig. 4). A dinâmica do ERK1/2 duplamente fosforilado é fortemente afetada tanto pelo p70s6k-IRS1 e ERK1/2-GRB2/SOS. Por outro lado, o estado de equilíbrio e comportamento dinâmico do GLUT4 na membrana não são afetados por ERK1/2, mas são fortemente afetados pela P70S6K-IRS1 ciclo de feedback negativo, confirmando assim a notável importância deste último mecanismo de controle na determinação da dinâmica de sistemas.

Simulado ppERK1/2-T202-Y204 (painel superior) e GLUT4 membrana concentração (painel inferior) perfis após a 100 nM de insulina estimulação, com o modelo completo (preto), o modelo sem p70S6K-IRS1 feedback (vermelho) e o modelo sem a ERK1/2-GS feedback (azul). Este último não afecta a concentração da membrana do glúteo 4.; portanto, os perfis Simulados do GLUT4 com e sem o feedback ERK1/2-GS são superimposíveis

é sabido que a resistência à insulina está associada a defeitos na sinalização dependente do IRS, implicando a sua desregulação no início e progressão da doença metabólica. Um ponto de vista emergente é que a regulação positiva/negativa das IRS pelas vias autólogas é subvertida na doença através do aumento das fosforilações basais e outras temporalmente inapropriadas da serina/treonina , que conduzem a uma redução da absorção de glucose. A hiperinsulinemia compensatória pode aumentar neste momento e conduzir, em última análise, à diabetes. Embora o IRS1 (e o IRS2) sejam regulados através de um mecanismo complexo que envolve fosforilação de mais de 50 diferentes resíduos de serina/treonina, no nosso modelo p70s6k-IRS1 o ciclo de feedback negativo parece essencial para um bom controlo da absorção de glucose. O aumento do ciclo de realimentação negativa P70S6K-IRS1 é capaz de explicar uma redução da sensibilidade à insulina e da captação de glucose (Fig. 5). Similarly( although they also hypothesize a positive feedback from mTOR to a different IRS1 Serine residue), Brännmark et al. , usando um modelo mínimo de sinalização de insulina, mostram que um mecanismo de feedback positivo diminuído é capaz de explicar uma redução da captação de glicose.

Simulado GLUT4 membrana de concentração em 60 min após diferentes de insulina estimulação, com o modelo completo (preto), o modelo sem p70S6K-IRS1 feedback (vermelho) e o modelo com maior p70S6K-IRS1 feedback, obtidos através do aumento do parâmetro k15 por 100% de seus vaue (verde)

Por outro lado, tanto P70S6K-IRS1 e ERK1/2-GRB2/SOS loops de feedback negativo parecem essenciais para garantir que duplamente ERK fosforilada mostra um transitórios de comportamento, com um pico em 10 min, seguido por um retorno para o condição inicial. Este comportamento já foi referido na literatura sob o estímulo da insulina e sob o estímulo do factor de crescimento epidérmico . Uma resposta ERK transitória previne uma activação sustentada do ERK que resultaria em proliferação celular contínua .

Análise de sensibilidade

para investigar mais profundamente o papel dos dois principais mecanismos de controlo na regulação dos efeitos-alvo, a análise de sensibilidade local foi realizada através da aplicação de uma pequena perturbação (0.1 % do valor do parâmetro) a um parâmetro de modelo de cada vez e avaliando as alterações relativas resultantes da translocação GLUT4 e da fosforilação ERK1/2 (ver Métodos). As tabelas 1 e 2 mostram os coeficientes de sensibilidade dos parâmetros do modelo, classificados de acordo com o seu valor absoluto e comparados com o valor que os coeficientes assumem após a remoção de p70s6k-IRS1 e ERK1/2-GRB2/SOS loops de feedback negativo. Estes coeficientes medem o efeito global, ou seja, durante a janela de observação, de uma alteração do parâmetro no resultado, ou seja, a resposta GLUT4 e ERK. Valores positivos/negativos significam que o aumento do valor do parâmetro tem o efeito de melhorar / reduzir a resposta. Uma vez que os pequenos valores absolutos significam que as alterações dos parâmetros não afetam significativamente o resultado, nas Tabelas 1 e 2, apenas o coeficiente superior a 0,1 % (valor absoluto), seja no modelo original ou modificado, são relatados.

Paramétrico, análise de sensibilidade do modelo completo para GLUT4 resposta revela que os mais sensíveis parâmetros estão relacionados com a translocação de GLUT4 para a membrana plasmática, seguido por aqueles relacionados à formação de lipídios e IRS1_PI3K formação do complexo/dissociação. A ausência de feedback p70S6K_IRS1 tem um forte impacto no aumento da sensibilidade (valor absoluto) dos parâmetros relacionados com a formação de lípidos e a formação do complexo IRS1_PI3K.

os parâmetros relacionados com a fosforilação/desphorilação da IRS1 na linha de base em Tyr / Ser têm menor sensibilidade, o que diminui (valor absoluto), em geral, ao remover o feedback de P70S6K-IRS1, com excepção do parâmetro k7p, relacionado com a fosforilação da IRS1 no Ser. Os parâmetros relacionados com a fosforilação IRS1 mediada pelo PKC no Ser também mostram valores aumentados após a remoção do feedback do P70S6K-IRS1. Uma vez que a remoção de feedback do ERK1/2-GRB2/SOS não tem efeito na translocação do GLUT4, os coeficientes de sensibilidade não mudam com e sem essa retroalimentação.

Paramétrico, análise de sensibilidade do modelo completo para ERK1/2 resposta mostra que os mais sensíveis parâmetros estão relacionados com o RAS MEK e RAF de ativação e para IRS1 fosforilação em Tyr e Serviços, este último mediada por p70S6K.Ao longo de ambos os PI3K-AKT e RAS-ERK1/2 via, ERK1/2-GRB2/SOS feedback parece ter um papel importante na robustez do sistema. A dinâmica do sistema é fracamente afectada pela sua ausência (ver Fig. 4), enquanto que a sensibilidade do parâmetro aumenta (em valor absoluto) em quase todos os casos se este feedback for removido.

conclusões sobre o efeito do feedback P70S6K-IRS1 sobre a resposta ERK1/2 são mais controversas. A remoção deste feedback tem o efeito de reduzir a sensibilidade dos parâmetros ao longo da via PI3K_AKT, enquanto que, ao longo da via RAS-ERK1/2, Quase não tem efeito nos parâmetros relacionados com a fosforilação de MEK, inactivação de RAF e fosforilação de ERK. Diminui a sensibilidade dos parâmetros relacionados com a activação de RAS, RAF e com a perturbação complexa IRS1-GRB2/SOS e IRS1-SHP2. Aumenta fortemente a sensibilidade dos parâmetros relacionados com a ativação da SRC e da RAF.

estes resultados destacam o papel central dos loops de feedback negativo na determinação não só da dinâmica de um sistema biológico, mas também da sua robustez. Esta propriedade é de notável importância porque preserva o comportamento dinâmico do sistema contra o ruído e pequenas flutuações biológicas comumente devido à variabilidade intercelular.