Bidimensional em gel de poliacrilamida para eletroforese (2D-PAGE): avanços e perspectivas

Introdução

nos últimos 25 anos, particularmente na última década, tem assistido a um aumento do esforço para desenvolver tecnologias capazes de identificar e quantificar um grande número de proteínas expressas em um sistema de célula (por exemplo, o proteoma), na esperança de detectar a doença de biomarcadores, mapeamento de proteína de circuitos, ou identificação de novas fosforilação sites, por exemplo. A complexidade do proteoma fez do desenvolvimento de métodos de separação eficiente e detecção sensível de proteínas um componente crítico deste esforço. Avanços contínuos na tecnologia de espectrometria de massa (MS) permitiram a detecção de proteínas com muito maior velocidade e sensibilidade do que anteriormente possível. Mesmo MS de ponta, no entanto, é incapaz de caracterizar todos os componentes dentro de um proteoma complexo. Os cientistas tomam uma abordagem “dividir para conquistar” para caracterizar proteomas, na qual eles tentam limitar temporariamente o número de proteínas que o espectrômetro de massa é solicitado a analisar. Ao espalhar o proteoma, mais proteínas serão finalmente analisadas dentro de uma experiência individual.

para separar os proteomas, os cientistas utilizaram tecnologias electroforéticas e cromatográficas, separadamente e em combinação, e tanto offline como online. Embora estes esforços possam resultar na separação e identificação de milhares de proteínas, nenhum método único pode resolver todas as proteínas em um proteoma, devido ao seu grande número e concentração dinâmica gama. As separações de dimensão única são inadequadas para resolver eficazmente misturas de proteínas complexas. Este fato foi reconhecido há mais de meio século por Smithies e Poulik (1), que reconheceu que uma combinação de duas eletroforética processos em gel em ângulos retos deve dar um maior grau de resolução que é possível com ambos separadamente. Os dois processos eletroforéticos São resolução por tamanho molecular e mobilidade de solução livre em um gel de amido. Sua previsão continua a ser comprovada e formou a base para o desenvolvimento de metodologias multidimensionais ortogonais para a separação de misturas complexas não só por eletroforese em gel, mas também por cromatografia e eletroforese capilar.

para compreender adequadamente os avanços feitos na página bidimensional (2D-PAGE), é preciso recuar muito mais do que um quarto de século. In 1930 Tiselius introduced the moving boundary method as an analytical to studying the electroforese of proteins (2). Desde seu trabalho pioneiro, várias formas de eletroforese têm sido usadas para a separação de misturas complexas de proteínas, cada uma com resolução melhorada. Já em 1962, Raymond e Aurell (3) demonstraram os efeitos significativos não lineares da concentração de gel na mobilidade electroforética das proteínas, empregando electroforese 2-D utilizando diferentes concentrações de gel de acrilamida para separar as proteínas séricas. Dois anos depois, Raymond (4) demonstrou a superioridade de géis de laje plana em comparação com géis de tubo cilíndrico. Por exemplo, a laje plana oferece o máximo de área de superfície para o arrefecimento do gel; os padrões resultantes são mais fáceis de quantificar no padrão de gravação de densitômetro; um grande número de amostras pode ser processado usando um único gel placa, facilitando a comparação direta de espécimes processados sob condições idênticas; e, mais importante, a laje plana permite a aplicação de 2-D separações. Estas preferências perspicazes têm sido comprovadas verdadeiras e são praticadas hoje em muitos laboratórios bioanalíticos.

outro avanço nas separações de gel 2-D foi introduzido em 1972 por Wright (5), que usou uma coluna de gel de poliacrilamida de 4,75% (2% de ligação cruzada) na primeira dimensão, que foi então removida do cilindro de vidro e colocada na borda superior de um declive de 2%. Após a electroforese, a laje de gel foi colocada numa solução de coloração, resultando na visualização de 112 proteínas séricas humanas resolvidas.

estas novas abordagens resolveram apenas um pequeno número de proteínas, principalmente as proteínas mais abundantes de um proteoma celular ou sérico. A introdução de 2D-PAGE em 1975 por O’Farrell (6) para a separação de proteínas celulares em condições de desnaturação permitiu a resolução de centenas de proteínas. O princípio aplicado era muito simples.: as proteínas foram resolvidos em gel usando isoeléctrico de focagem (IEF), que separa as proteínas na primeira dimensão de acordo com seu ponto isoeléctrico, seguido de eletroforese em uma segunda dimensão, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS), que separa as proteínas de acordo com sua massa molecular. O método de O’Farrell é realmente a base da página 2D moderna, que foi rapidamente adaptada e amplamente aceita por outros pesquisadores. Anderson and Anderson (7) used 2D-PAGE for the analysis of human plasma proteins. Eles foram capazes de se separar e detectar cerca de 300 pontos de proteína distintos após a coloração. Ao contrário de O’Farrell, Manabe (8) separou proteínas plasmáticas humanas usando 2D-PAGE sem agentes desnaturantes. Cerca de 230 manchas proteicas podem ser observadas no gel; no entanto, as manchas foram manchadas e não bem resolvidas.

introdução de gradientes de pH imobilizados

como mencionado acima, 2D-PAGE compreende IEF na primeira dimensão, seguido de SDS-PAGE na segunda dimensão. Desde a sua introdução pela Kolin em 1954 (9), O IEF passou por vários avanços. A primeira dimensão é realizada em varetas de gel de poliacrilamida formadas em tubos de vidro ou plástico e contêm ampolitos que formam um gradiente de pH num campo elétrico. Estas barras foram historicamente irrepreensíveis, instáveis e difíceis de trabalhar. The introduction of immobilized pH gradients (IPGs) by Bjellqvist et al. (10) teve um impacto significativo na utilização da pai para separar misturas complexas numa vasta gama de pH. O IPGs permitiu a formação de gradientes de pH estáveis e reprodutíveis, capazes de concentrar proteínas ácidas e básicas em um único gel preparado com gradientes de pH largo. Em IPGs, os ampholytes portadores são ligados às moléculas de acrilamida e lançados no gel para formar um gradiente de pH fixo. A fixação do gradiente impede a deriva no gel e também garante que eles podem ser moldados de uma forma eficiente e reprodutível. A utilização de faixas IPG de gama estreita permitiu a separação de um maior número de proteínas do que tinha sido possível com a página 2D-padrão porque um intervalo de pH mais estreito foi espalhado por uma maior distância física. Esta disseminação permitiu que proteínas com valores semelhantes de ponto isoelétrico (pI) fossem separadas com maior resolução. Para ilustrar este ponto, Hoving et al. desenvolveu um método de 2D-PAGE no qual aplicavam faixas IPG de gama estreita na primeira dimensão (11). As tiras de IPG eram tipicamente de 1-3 pH U de largura e sobrepostas em pelo menos 0,5 pH U. seis tiras de IPG cobrindo o intervalo de pH de 3,5 a 10 foram usadas. As proteínas de uma linha celular de linfoma-B foram aplicadas a cada faixa e separadas utilizando a FEI. Cada tira foi então aplicada a uma placa de gel SDS-PAGE e as proteínas foram separadas na segunda dimensão com base no seu peso molecular. Aproximadamente 5000 pontos distintos foram detectados usando as seis tiras de IPG, em comparação com 1500 pontos detectados usando uma única tira de IPG com uma faixa de pH de 3-10 e uma única placa padrão de gel de 2D-PAGE. Wildgruber et al. (12) comparou a utilização de 3 faixas IPG com intervalos de pH de 4-5, 5-6 e 5.5–6.7 com faixas IPG com intervalos de pH gradiente de 3-10 e 4-7. Eles foram capazes de detectar 2,3 e 1,6× mais pontos proteicos usando três faixas IPG de faixa estreita do que com as duas faixas IPG de faixa maior gradiente (3-10 e 4-7), respectivamente.

enquanto que a maior resolução obtida usando IPGs estreitos sobrepostos múltiplos permite a identificação de mais proteínas, cada faixa estreita requer uma placa de gel separada e uma certa quantidade da mesma amostra a ser carregada em cada uma. Este requisito significa que, se o volume ou concentração da amostra for limitado, tal experiência pode não ser possível. Para amostras limitadas, deve ser considerada uma gama de pH mais ampla ou um número mínimo de IPGs.

diferencial bidimensional de electroforese em gel (2D-DIGE)

o objectivo de separar as proteínas usando a página 2D é duplo.: I) identificação de novas proteínas e ii) medição da sua abundância relativa entre amostras comparativas. Uma vantagem de 2D-PAGE como uma técnica de separação é que não só resolve um grande número de proteínas, mas a coloração destas proteínas permite quantificar a abundância relativa das proteínas. Por exemplo, as proteínas extraídas de duas amostras de soro (saudáveis e doentes) são carregadas numa placa de gel separada. Após a coloração, as manchas proteicas são alinhadas e digitalizadas para medir suas intensidades individuais. Embora muitos avanços em ferramentas de alinhamento de software tenham sido feitos, tem sido um desafio garantir a comparação direta local-a-local entre dois géis separados. O desenvolvimento da electroforese em gel com diferencial 2-D (DIGE) em 1997 superou esta limitação ao permitir que até três misturas proteicas distintas fossem separadas dentro de um único gel de 2D-PAGE (13). Em um experimento típico de 2D-DIGE, proteínas extraídas de três amostras diferentes, saudável, doente e controle interno (uma amostra combinada formada a partir da mistura de quantidades iguais das proteínas extraídas das amostras saudáveis e doentes), são covalentemente rotuladas, cada uma com um corante fluorescente cianina que tem uma excitação diferente e comprimento de onda de emissão. As amostras são migração igualada, de modo que a mesma proteína marcada com qualquer um dos corantes irá migrar para a mesma posição no gel. Os corantes de cianina utilizados são:: 1-(5-carboxy-pentil)-1′-propylindocarbacyanine haleto de N-hydroxysuccinimidyl éster (Cy3); 1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindodicar-bacyanine haleto de N-hydroxysuccinimidyl éster (Cy5); e 3-(4-carboximetil)fenil-metil-3′-ethyloxacarbacyanine haleto de N-hydroxysuccinimidyl Éster (cy2). Concentrações iguais das diferentes proteínas rotuladas e da amostra de controle são misturadas, aplicadas a uma única placa de gel, e separadas usando 2D-PAGE. A amostra de controlo serve como um padrão interno, permitindo tanto a correspondência entre gel e gel. A amostra de controlo deve conter todas as proteínas presentes em todas as amostras numa experiência. Isto significa que cada proteína no experimento tem um sinal único no padrão interno, que é usado para comparações quantitativas diretas dentro de cada gel e para normalizar valores quantitativos de Abundância para cada proteína entre géis. Scaning the gel at the specific excitation wavelengths of each dye, using a fluorescence imager, allows visualization of the differentially labeled proteins (Figure 1). As imagens são então fundidas e analisadas usando software de imagem, o que permite que as diferenças entre os níveis de abundância de proteínas sejam comparadas. O valor em DIGE elimina qualquer erro relacionado ao desalinhamento do gel e garante a quantificação exata (14).

proteínas de interesse são excisadas do gel, digeridas proteoliticamente, e identificadas usando em. Uma vez que é realizada usando uma placa de gel único, 2D-DIGE requer 50% menos géis, tornando-o mais econômico e diferenças na expressão proteica entre duas amostras diferentes de proteínas mais fáceis de comparar e mais precisamente fotografadas. Além disso, é necessário menos tempo para detectar as manchas proteicas porque a reação de rotulagem em DIGE é mais rápida do que a visualização usando métodos de coloração. Quando há necessidade de comparar os níveis de expressão proteica de duas amostras diferentes, DIGE é o método de escolha (15).

dosagens e pontos fracos de 2D-PAGE

a electroforese é uma técnica estabelecida que sofreu vários avanços que melhoraram a resolução, detecção, quantificação e reprodutibilidade. As abordagens 2-D SDS-PAGE e 2D-DIGE para a caracterização de proteínas são métodos acessíveis e econômicos que possuem alta resolução de poder e permitem a detecção de centenas de proteínas em uma única placa de gel. Embora a reprodutibilidade tenha sido um problema com 2D-PAGE, especialmente quando se perfilam duas misturas de proteínas, ela foi muito melhorada com o uso de 2D-DIGE. A resolução foi melhorada pela introdução de IPGs, que permitem ao analista adaptar o gradiente de pH para a resolução máxima usando géis ultrazoom com uma faixa estreita de gradiente de pH. Com a página 2D moderna, não é incomum resolver duas proteínas que diferem em pI por 0,001 U.

embora a página 2D tenha sido limitada por sua incapacidade de resolver proteínas que são muito básicas ou muito ácidas, muito grandes ou muito pequenas, esta limitação está diminuindo continuamente. Por exemplo, a separação de proteínas básicas pode ser analisada usando IPGs na faixa de pH de 4-12. A Ciência da separação está sempre evoluindo, e não demorará muito até que as questões restantes da eletroforese em gel sejam resolvidas adequadamente.

a introdução do 2D-DIGE contribuiu imensamente para resolver problemas de reprodutibilidade e quantificação. O uso de imagens e computadores permite não só mineração rápida de dados, aquisição e análise, mas também detecção de pontos, normalização, análise de perfis de proteínas, correção de fundo, e relatórios e exportação de dados. Como técnica de separação, detecção e quantificação, 2D-DIGE é uma ferramenta importante, especialmente para laboratórios clínicos envolvidos na determinação dos níveis de expressão proteica e descoberta de biomarcadores de doenças. Quando a variação biológica absoluta entre amostras é o principal objetivo, como na descoberta de biomarcadores, 2D-DIGE é o método de escolha.

embora tenha havido progressos significativos em métodos de nongel (ou baseados em solução) para o acoplamento de métodos de fraccionamento diretamente online com análise em, 2D-PAGE tem permanecido uma técnica popular para a realização de estudos proteômicos. Embora 2D-PAGE, como qualquer esquema de fraccionamento, tem suas vantagens e desvantagens, não há dúvida de que continuará a ser uma técnica essencial para a caracterização de proteomas por muitos anos vindouros.