Fatores de ligação para o pro-COL1A2 proximal promotor
Vários funcional cis-elementos de atuação foram identificadas em cerca de 400 bp proximal promotor do mouse pro-gene Col1a2 (154-2350 bp) e o homem, o mínimo de sequência entre 152 e 2378 bp. O primeiro factor de transcrição que se verificou ligar a este promotor foi a onipresente proteína de ligação do CCAAT CBF. Este fator de transcrição é formado por três subunidades separadas, chamadas A, B E C, que foram todas clonadas e sequenciadas (Maiy e de Crombrugghe, 1998). Todas as três subunidades são necessárias para que CBF se ligue à sequência que contém a caixa CCAAT localizada entre 284 e 280 e ativar a transcrição em ambos os genes humanos e mouse (ver Fig. 13.2 B). In vitro data suggest that the A and C subunits first associate to form an A-C complex and that this complex then forms a heteromeric molecule with the B subunit (Sinha et al., 1995). As mutações na caixa do CCAAT que impedem a ligação do CBF diminuem a actividade transcritiva do promotor proximal pro-Col1a2 três a cinco vezes em experiências de transfecção transitória de linhas celulares fibroblásticas (Coustry et al., 1995). O CBF purificado e o CBF composto pelas suas três subunidades recombinantes activam também o promotor pro-Col1a2 em extractos nucleares livres de células anteriormente esgotados do CBF (Coustry et al., 1995). Duas das três subunidades do CBF contêm domínios de ativação transcritional. Mais recentemente, uma única substituição de T para um in vivo na presença de um potenciador upstream da sequência humana sugeriu que CBF está envolvido na padronização da expressão de colágeno tipo I no dorsoventral, bem como no eixo rostrocaudal dos fibroblastos da pele do rato (Tanaka et al., 2004).
além do local de ligação para CBF, os estudos de pegada e pegada identificaram outros locais de ligação no primeiro 350 bp do promotor pró-Col1a2 do rato. Três sequências ricas em GC, localizadas a cerca de 2160 bp (entre 2176 e 2152 bp) e 2120 bp (entre 2131 e 2114 bp), demonstraram interagir com proteínas de ligação ao ADN através de experiências de pegada e testes de mudança de gel (Hasegawa et al., 1996). Uma eliminação no promotor do rato que abrange estas três sequências de pegada aboliu completamente a actividade transcritiva do promotor Pro-Col1a2 proximal em experiências de transfecção transitória utilizando linhas celulares fibroblásticas. As regiões correspondentes do promotor humano pró-COL1A2 também foram protegidas em experiências in vivo e in vitro de pegada (Nhi et al., 1996) and bound transcriptional activators. No entanto, os ensaios de mudança de gel efectuados com o promotor humano pró-COL1A2 sugeriram que um elemento de Acção cis localizado a 2160 bp representa um elemento repressor (Nhi et al., 1996), implicando que interações entre proteínas interagindo com os elementos ativadores em 2300, 2125, e 280 bp e proteínas ligando-se a um elemento repressor em 2160 bp regulam este gene. Mais recentemente, foi demonstrado que o CUX1, uma proteína de deslocamento do CCAAT, está associado a uma expressão reduzida do colagénio de tipo I, tanto in vivo como in vitro, e que o aumento da expressão do CUX1 resulta numa supressão efectiva do colagénio de tipo I interferindo com a ligação do CBF (Fragiadaki et al., 2011).Demonstrou-se que
Sp1 e Sp3 ligam o motivo TCCTCC localizado entre 2123 e 2128 bp; ambos os factores de transcrição activam este promotor (Nhi et al., 2001) (ver Fig. 13.2 B). Além disso, as proteínas que se ligam aos dois segmentos proximais também se ligam ao segmento mais rico em GC a montante, a 2300 bp, com excepção do CBF, sugerindo uma redundância entre os segmentos de ADN funcionalmente activos do promotor Pro-COL1A2 proximal.
TGFß medeia a sua acção humana, de promotor, através da combinação do onipresente fator de transcrição Sp1, o Smad3/4 complexo, e os coativadores p300/CREB-proteína de ligação (CBP), em o que é chamado de um TGFß-responsive element (TßRE) (Zhang et al., 2000). Este segmento contém três motivos ricos em GC entre 2330 e 2255, capazes de ligar Sp1, proteína de ligação CCAAT/enhancer (C/EBP), proteína activadora 1 (AP1), e complexos Smad (Chen et al., 1999,2000a, b; Kanamaru et al., 2003; Tamaki et al., 1995; Zhang et al., 2000). A interacção entre estes factores nucleares é sinérgica e exige a ligação do Sp1 e do Smad3 / 4 aos elementos ricos em GC e ao sítio SMAD CAGAC a jusante, respectivamente (Ghosh et al., 2000; Poncelet and Schnaper, 2001; Zhang et al., 2000). Na virada deste século, houve um grande debate sobre se as PMS são mais importantes do que AP1 no promotor proximal. Isso foi resolvido há cerca de 10 anos mais tarde, quando foi mostrado que o TGFß também ativa o gene COL1A2 através de um noncanonical (Smad-independente) vias de sinalização, que exige enhancer/promotor de cooperação envolvendo troca de c-Jun/JunB fator de transcrição da ocupação de um crítico do realçador do site, resultando na estabilização do enhancer/promotor de coalescência (Ponticos et al., 2009). Um relatório que explora os efeitos da hipoxia e do TGFß no gene COL1A2 adicionou ao potencial papel das PMS, em particular do Smad3, na regulação da expressão do colagénio. Estes estudos em humanos mesangial células sugerem que, sob condições hipóxicas e na presença de TGFß, hipóxia-inflamação induzida por fator 1α (HIF-1α) e Smad3 pode formar complexos de transcrição e, de preferência, melhorar a ligação para um dos três hipóxia resposta de elementos dentro do humano COL1A2 promotor na posição -335 bp (Baumann et al., 2016). Os autores sugerem que esta nova interação fornece um mecanismo que explica a sinergia observada entre HIF e TGFß na fibrose renal.
TNFa e interferão-γ (IFN-γ) suprimem a produção em matrizes. Em contraste com o único elemento de ADN que Media a estimulação TGFß do promotor proximal do COL1A2, tanto o TNFa como o IFN-γ demonstraram inibir a transcrição do COL1A2 interferindo na formação do complexo induzido pelo TGFß e estimulando a interacção de factores negativos com elementos de ADN sensíveis localizados em 5′ e 3′ do mesmo. Este chamado “elemento sensível às citocinas” desempenha um papel importante na manutenção da homeostase. O envolvimento de AP1 e NF-kB na transdução da acção inibitória do TNFa na expressão do gene COL1A2 foi demonstrado utilizando fibroblastos imortalizados de ratos que não possuem nem o activador AP1 Jun N-terminal kinase 1 (JNK1) ou o modulador essencial NF-kB NEMO. Especificamente, a perda do JNK1 impediu o antagonismo do TNFa do TGFß, mas preservou a inibição do TNFa da expressão constitutiva do COL1A2. O antagonismo do TGFß por TNFa envolve a fosforilação do JNK1 de C-jun, levando à competição fora do DNA desta última molécula para a ligação do Smad3 ao local do ADN cognato e/ou para a interacção com os co-activadores p300 / CBP (Kouba et al., 1999; Verrecchia et al., 2001, 2002).
a ligação do IFN-γ aos seus receptores leva à fosforilação da tirosina da tirosina cinase (JAK) e isto, por sua vez, resulta em transdutor de sinal e activador da fosforilação (STAT1). No COL1A2, a activação do STAT1 resulta em concorrência com o Smad3 para a interacção com o p300/CBP (Inagaki et al., 2003). Além disso, o JAK1 pode também activar o factor de transcrição Y-box (YB-1); Esta activação resulta tanto na inibição da actividade constitutiva do promotor através da ligação YB-1 da caixa 2125TC como no antagonismo dos sinais TGFß através da competição YB-1 com o Smad3 e/ou o p300/CBP (Ghosh et al., 2001; Higashi et al., 2003). Para mais detalhes, consulte” fatores de crescimento “e” citocinas.”
Est1 / Fli1 também demonstraram ligar a mesma sequência com efeitos opostos na transcrição do tipo I do colagénio. Um factor de transcrição funcional Ets foi identificado no COL1A2 na proximidade de locais Sp1. O Ets1 estimulou, enquanto o Fli1 inibiu, a actividade de promotor. A ligação do Sp1 foi essencial para a inibição do Fli1. Além disso, a sobreexpressão do Fli1 nos fibroblastos dérmicos levou a uma diminuição dos níveis de mRNA e proteínas COL1A2 (Czuwara-Ladykowska et al., 2001). Além disso, o tratamento de TGFß dos fibroblastos dérmicos leva à dissociação do Ets1 dos complexos CBP/p300 e altera a sua resposta ao TGFß em favor da degradação da matriz (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).
além disso, um motivo CpG a 17 bp demonstrou ser preferencialmente metilado e ligado por proteínas RFX em células que adquirem um estado colagénio I–negativo. Experiências de transfecção celular em conjunto com ensaios de ligação ao ADN atribuíram propriedades positivas ou negativas a cada uma das proteínas que se ligam ao promotor proximal do pro-COL1A2 (Sengupta et al., 2002). O grau de metilação no local de 17 CpG, por outro lado, demonstrou modular a afinidade de ligação das proteínas RFX e, consequentemente, a sua capacidade para reduzir a actividade do promotor, recrutando proteínas associadas que interferem com a montagem de complexos transcritionais de acção positiva (Xu et al., 2003, 2004).