c Methylating Agentes
A sensibilidade cruzada de certas cepas de bactérias para a irradiação UV e o mono-funcional de agente alquilante MMS, em contraste com os compostos analisados até agora, não parece ser devido a um reconhecimento semelhante sujeitos a impostos especiais de danos causados pelo mesmo endonuclease que reconhece dímeros de timina no DNA. A existência de bactérias mutantes sensíveis a MMS é prima facie, a existência de mecanismos de reparação do tipo selvagem, mas agora parece que ele não é um alquilados da base de dados de per se, que é reconhecido por um mecanismo de reparação, mas, provavelmente, um single-strand break no DNA. A seguir MMS tratamento, B. subtilis foi inativada pela formação de single-strand quebras no DNA, o que foi demonstrado, de tipo selvagem, B. subtilis pode reparar (Strauss e Wahl, 1964; Prakash e Strauss, 1970); no entanto, um MMS mutante sensível era deficiente ou falta desta capacidade. Além disso, argumentou-se que a sensibilidade cruzada observada aos raios UV ou x poderia ser explicada pela formação de quebras de uma cadeia única que se sabe serem formadas por estes últimos agentes.
a confirmação deste ponto de vista foi obtida a partir das propriedades de um mutante B. subtilis que era sensível à irradiação UV, mas não a MMS (Searashi e Strauss, 1965). Que a metilação de bases de ADN, em vez de fracturas da cadeia induzida pelo MMS, não evoca qualquer reparação de excisão em B. o subtilis também foi claramente demonstrado pela incapacidade de observar qualquer perda significativa de grupos metilo do ADN de células de tipo selvagem ou sensíveis durante várias gerações de células. Este achado indica a capacidade das células para replicar o DNA metilado e é consistente com a capacidade replicativa do DNA modificado pela arilalquilação (Venitt e Tarmy, 1972).
o estudo acima referido sobre a reparação de lesões da metilação induzida por MMS em B. a subtilis pode, por conseguinte, ser contrastada com outros estudos sobre a reparação de danos de alquilação introduzidos pelo agente monofuncional de metilação MNNG (Lawley e Orr, 1970) na E. coli B/R. difere da MMS na produção de uma proporção sensivelmente superior de resíduos de o 6-metilguanina no ADN alquilado. Este produto, bem como a 3-metiladenina e, possivelmente, alguns produtos não identificados (material de origem em cromatogramas de papel), parecem ser selectivamente excisados em comparação com a perda de n −7-metilguanina do ADN das células de E. coli B/r, em condições que permitem tanto o crescimento como a síntese de ADN. A 3-Metiladenina e a 6-metilguanina, mas não a matéria de origem, foram também excisadas a partir de células Bs–1, mas possivelmente a uma taxa reduzida. Não foi indicado por Lawley e Orr se havia ou não qualquer diferença na sobrevivência das células B/r E Bs-1 tratadas MNG, o que poderia indicar que tais diferenças na capacidade de excisão refletem o funcionamento de um mecanismo de reparação do DNA que auxilia a sobrevivência celular. No entanto, Kondo et al. (1970) não relatou aumento da letalidade ou aumento da frequência de mutação na E. coli, para estirpes incapazes de excisar dimeros de pirimidina, após tratamento com MNNG, em comparação com MMS. Isto apesar do fato de que a alquilação do DNA por MNNG produz 20 vezes a quantidade de o 6-metilguanina do que é produzida por alquilação do DNA por MMS (Lawley et al., 1971–1972).
Evidência de que essa “perda” de 3-methyladenine e O 6-methylguanine é mediado por um enzymic excisão mecanismo, diferente de um UV endonuclease, teve origem em estudos in vitro, sobre as propriedades de uma enzima, designada endonuclease II, isolados de E. coli (Friedberg e Goldthwait, 1969). Esta enzima é capaz de quebrar ligações fosfodiester no ADN que tem sido reagido com o Agente alquilante MMS e de reconhecer locais depurinados no ADN. Mais recentemente, foi demonstrado que liberta o 6-metilguanina e n 3-metiladenina, mas não n 7-metilguanina a partir de ADN que tinha sido metilado pelo carcinogénio MNU (Kirtikar e Goldthwait, 1974). Endonuclease II, portanto, claramente possui muitas funções diferentes, um dos quais parece capaz de romper ligações glicosídicas ligado a certas substituído purinas. Por outro lado, pode ser uma mistura de enzimas. A existência de uma enzima que é igualmente capaz de realizar esta clivagem postulada de ligações n-glicosídicas (e portanto chamada N-glicosidase) foi recentemente isolada de E. coli e mostrou libertar uracilo livre de resíduos de citosina desaminados contendo ADN (Lindahl, 1974). O local despurinado resultante pode então ser reconhecido e reparado por outro sistema enzimático associado (cf. Verly and Paquette, 1972). Foi também observada especificidade de uma preparação de E. coli para a 3-alquiladenina, mas não para a 7-alquiladenina pelo Papirmeister et al. (1970). Verificou-se que a 3 −Etiladenina e a 6-etilguanina, mas não os resíduos de n-7-etilguanina no ADN formado pela reacção de N-etil-n-nitrosoureia, eram igualmente excisados do ADN de E. coli WP2 (Lawley and Warren, 1975). A excisão dos produtos menores da alquilação das purinas foi agora observada in vivo em células de mamíferos e, além disso,a diminuição da capacidade de excisão em certos tecidos foi correlacionada com a identidade do órgão-alvo para alguns carcinogénios alquilantes (ver secção I, C da Parte B).
A aparente falta de reconhecimento e de excisão de N 7-alkylguanine resíduos de DNA por um mecanismo de reparação, como indicado por estudos de Prakash e Strauss (1970) e por Lawley e Orr (1970), também era evidente em estudos por Kimball et al. (1971a) on the effects of MMS and MNNG in Haemophilus influenzae. É, portanto, algo surpreendente que este mesmo resíduo pareça ser reconhecido em Euglena gracilis. Após metilação com N-metil-N-nitroso-p-toluenossulfonato, a 7-metilguanina perdeu-se do ADN com uma semi–vida de 10 h (Olson e McCalla, 1969) sensivelmente inferior à semi-vida de aproximadamente 5 dias para hidrólise espontânea a pH 7.4 no tampão ácido cítrico-fosfato (Margison et al., 1973). Além disso, uma estirpe mutante resistente aparentemente excisou a n −7-metilguanina mais rapidamente do que a estirpe sensível com o aparecimento de mononucleótidos do ADN degradado no sobrenadante celular (Olson e McCalla, 1969). Esta conclusão inesperada merece, por conseguinte, uma investigação mais aprofundada. Estes resultados, em seguida, juntamente com a ligeira indicação de uma perda mais rápida de 7-metilguanina do ADN do fígado de rato in vivo observado por Margison et al. (1973), mas não pela arinca (1973a), pode sugerir que este substituinte de ADN pode ser reconhecido por uma enzima de reparação em determinadas circunstâncias.
a tabela VI resume os exemplos anteriores da perda de produtos químicos do DNA bacteriano.