factori legați de promotorul proximal pro-COL1A2
mai multe elemente funcționale cis-acting au fost identificate în promotorul proximal de aproximativ 400-bp al genei Pro-Col1a2 de șoarece (154-2350 bp) și secvența minimă umană între 152 și 2378 BP. Primul factor de transcripție care s-a dovedit a se lega de acest promotor a fost proteina omniprezentă care leagă CCAAT CBF. Acest factor de transcripție este format din trei subunități separate, numite A, B și C, care au fost clonate și secvențiate (Maity și de Crombrugghe, 1998). Toate cele trei subunități sunt necesare pentru ca CBF să se lege de secvența care conține caseta CCAAT situată între 284 și 280 și să activeze transcrierea atât în genele umane, cât și în cele de șoarece (vezi Fig. 13.2 B). Datele in vitro sugerează că subunitățile A și C se asociază mai întâi pentru a forma un complex A–C și că acest complex formează apoi o moleculă heteromerică cu subunitatea b (Sinha și colab., 1995). Mutațiile din cutia CCAAT care împiedică legarea CBF scad activitatea transcripțională a promotorului proximal pro-Col1a2 de trei până la cinci ori în experimentele de transfecție tranzitorie a liniilor celulare fibroblastice (Coustry și colab., 1995). CBF purificat, precum și CBF compus din cele trei subunități recombinante, activează, de asemenea, promotorul pro-Col1a2 în extractele nucleare fără celule epuizate anterior de CBF (Coustry și colab., 1995). Două dintre cele trei subunități ale CBF conțin domenii de activare transcripțională. Mai recent, o singură substituție a T cu un A in vivo în prezența unui amplificator în amonte al secvenței umane a sugerat că CBF este implicat în modelarea expresiei de colagen de tip I în axa dorsoventrală, precum și în axa rostrocaudală a fibroblastelor pielii de șoarece (Tanaka și colab., 2004).
în plus față de site-ul de legare pentru CBF, experimentele de amprentare și studiile de schimbare a gelului au identificat alte site-uri de legare în primele 350 bp ale promotorului Pro-Col1a2 al mouse-ului. Trei secvențe bogate în GC, situate la aproximativ 2160 bp (între 2176 și 2152 bp) și 2120 bp (între 2131 și 2114 bp) s-au dovedit a interacționa cu proteinele care leagă ADN-ul prin experimente de amprentă și teste de schimbare a gelului (Hasegawa și colab., 1996). O ștergere a promotorului mouse-ului care cuprinde aceste trei secvențe amprentate a abolit complet activitatea transcripțională a promotorului proximal pro-Col1a2 în experimentele de transfecție tranzitorie folosind linii celulare fibroblastice. Regiunile corespunzătoare din promotorul uman Pro-COL1A2 au fost, de asemenea, protejate în experimente de amprentare in vivo și in vitro (Ihn și colab., 1996) și activatori transcripționali legați. Cu toate acestea, testele de schimbare a gelului efectuate folosind promotorul uman pro-COL1A2 au sugerat că un element care acționează cis situat la 2160 bp reprezintă un element represor (Ihn și colab., 1996), ceea ce implică faptul că interacțiunile dintre proteinele care interacționează cu elementele Activatoare la 2300, 2125 și 280 bp și proteinele care se leagă de un element represor la 2160 bp reglează această genă. Mai recent s-a demonstrat că CUX1, o proteină de deplasare CCAAT, este asociată cu expresia redusă a colagenului de tip I atât in vivo, cât și in vitro și că îmbunătățirea expresiei CUX1 are ca rezultat suprimarea eficientă a colagenului de tip i prin interferența cu legarea CBF (Fragiadaki și colab., 2011).S-a demonstrat că
Sp1 și Sp3 leagă motivul TCCTCC situat între 2123 și 2128 bp; ambii factori de transcripție activează acest promotor (Ihn și colab., 2001) (vezi Fig. 13.2 B). Mai mult, proteinele care se leagă de cele două segmente proximale se leagă și de cel mai bogat segment GC în amonte, la 2300 bp, cu excepția CBF, sugerând o redundanță între segmentele ADN active funcțional ale promotorului proximal pro-COL1A2.
TGF XV își mediază acțiunea în promotorul uman prin combinarea factorului de transcripție omniprezent Sp1, a complexului Smad3/4 și a coactivatorilor P300/proteina de legare a CREB (CBP) în ceea ce se numește element TGF-responsive (t Otrivtre) (Zhang și colab., 2000). Acest segment conține trei motive bogate în GC între 2330 și 2255, capabile să lege Sp1, CCAAT/proteina care leagă amplificatorul (c/EBP), proteina Activatoare 1 (AP1) și complexele Smad (Chen și colab., 1999,2000A, b; Kanamaru și colab., 2003; Tamaki și colab., 1995; Zhang și colab., 2000). Interacțiunea dintre acești factori nucleari este sinergică și necesită legarea Sp1 și Smad3/4 la elementele bogate în GC și respectiv la situl SMAD cagac din aval (Ghosh și colab., 2000; Poncelet și Schnaper, 2001; Zhang și colab., 2000). La începutul acestui secol, a existat o mare dezbatere dacă Smad-urile sunt mai importante decât AP1 în promotorul proximal. Acest lucru a fost rezolvat cu aproximativ 10 ani mai târziu, când s-a demonstrat că TGF XV activează, de asemenea, gena COL1A2 printr-o cale de semnalizare necanonică (independentă de Smad), care necesită o cooperare de îmbunătățire/promotor care implică schimbul de ocupare a factorului de transcripție c-Jun/JunB a unui sit critic de îmbunătățire, rezultând stabilizarea coalescenței potențiator/promotor (Ponticos și colab., 2009). Un raport care explorează efectele hipoxiei și TGF-ului asupra genei COL1A2 a adăugat la rolul potențial al Smad – urilor, în special Smad3, în reglarea expresiei colagenului. Aceste studii efectuate pe celule mezangiale umane sugerează că, în condiții hipoxice și în prezența TGF CTF, factorul inductibil de hipoxie 1 CTF (HIF-1 CTF) și Smad3 pot forma complexe transcripționale și pot spori în mod preferențial legarea la unul dintre cele trei elemente de răspuns la hipoxie din cadrul promotorului COL1A2 uman la poziția -335 bp (Baumann și colab., 2016). Autorii sugerează că această interacțiune nouă oferă un mecanism care explică sinergia observată între HIF și TGF în fibroza renală.
TNFa și interferon-iti (IFN-ti) suprimă producția de matrice. Spre deosebire de elementul ADN unic care mediază stimularea TGF-ul a promotorului proximal COL1A2, s-a demonstrat că atât TNFa, cât și IFN-ul-ul inhibă transcripția COL1A2 prin interferența cu formarea complexului indus de TGF-ul-ul și prin stimularea interacțiunii factorilor negativi cu elementele ADN receptive situate 5′ și 3′ ale acestuia. Acest așa-numit „element receptiv la citokine” joacă un rol important în menținerea homeostaziei. Implicarea AP1 și NF-kB în transducerea acțiunii inhibitoare a TNFa asupra expresiei genei COL1A2 a fost demonstrată folosind fibroblaste imortalizate de la șoareci cărora le lipsește fie activatorul AP1 Jun n-terminal kinaza 1 (JNK1), fie modulatorul esențial NF-kB NEMO. În mod specific, pierderea JNK1 a împiedicat antagonismul TNFa al TGF XV, dar a păstrat inhibarea TNFa a expresiei constitutive COL1A2. Antagonismul TGF de către TNFa implică fosforilarea JNK1 A C-jun, ducând la concurența în afara ADN-ului a acestei din urmă molecule pentru legarea Smad3 la situsul ADN înrudit și/sau pentru interacțiunea cu coactivatorii p300/CBP (Kouba și colab., 1999; Verrecchia și colab., 2001, 2002).
legarea IFN-XV de receptorii săi duce la fosforilarea tirozinei a tirozin kinazelor janus kinazei (JAK) și, la rândul său, are ca rezultat traductorul de semnal și activatorul fosforilării transcripției (STAT1). În COL1A2, activarea STAT1 are ca rezultat concurența cu Smad3 pentru interacțiunea cu p300 / CBP (Inagaki și colab., 2003). În plus, JAK1 poate activa, de asemenea, factorul de transcriere factorul de legare a cutiei Y (YB-1); această activare are ca rezultat atât inhibarea activității promotorului constitutiv prin legarea YB-1 a casetei 2125tc, cât și antagonismul semnalelor TGF XV prin concurența YB-1 cu Smad3 și/sau p300/CBP (Ghosh și colab., 2001; Higashi și colab., 2003). Pentru mai multe detalii, consultați „factori de creștere” și „citokine.”
Est1/Fli1 s-a dovedit, de asemenea, că leagă aceeași secvență cu efecte opuse asupra transcrierii colagenului de tip I. Un factor de transcripție Ets funcțional a fost identificat în COL1A2 în imediata apropiere a siturilor Sp1. Ets1 stimulat, întrucât Fli1 inhibat, activitatea promotor. Legarea Sp1 a fost esențială pentru inhibarea Fli1. Mai mult, supraexprimarea Fli1 în fibroblastele dermice a dus la o scădere a ARNm COL1A2 și a nivelurilor de proteine (Czuwara-Ladykowska și colab., 2001). În plus, tratamentul cu TGF XV al fibroblastelor dermice conduce la disocierea Ets1 de complexele CBP/p300 și modifică răspunsul acestora la TGF XV în favoarea degradării matricei (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).
mai mult, un motiv CpG la 17 bp s–a dovedit a fi preferențial metilat și legat de proteinele RFX din celulele care dobândesc o stare de colagen i-negativ. Experimentele de transfecție celulară împreună cu testele de legare a ADN-ului au atribuit proprietăți pozitive sau negative fiecăreia dintre proteinele care se leagă de promotorul proximal al pro-COL1A2 (Sengupta și colab., 2002). Gradul de metilare la locul 17 CpG, pe de altă parte, s-a dovedit a modula afinitatea de legare a proteinelor RFX și, în consecință, capacitatea lor de a regla activitatea promotorului prin recrutarea de proteine asociate care interferează cu asamblarea complexelor transcripționale cu acțiune pozitivă (Xu și colab., 2003, 2004).