Electroforeza în gel de poliacrilamidă bidimensională( pagina 2D): progrese și perspective

Introducere

ultimii 25 de ani, și în special ultimul deceniu, au fost martorii unui efort sporit de a dezvolta tehnologii capabile să identifice și să cuantifice un număr mare de proteine exprimate într-un sistem celular (adică proteomul) în speranța detectării biomarkerilor bolii, cartografierea circuitelor proteice sau identificarea unor noi site-uri de fosforilare, de exemplu. Complexitatea proteomului a făcut din dezvoltarea metodelor de separare eficientă și detectare sensibilă a proteinelor o componentă critică a acestui efort. Progresele continue în tehnologia spectrometriei de masă (MS) au permis detectarea proteinelor cu o viteză și sensibilitate mult mai mari decât era posibil anterior. Chiar și SM de ultimă oră, totuși, nu este în măsură să caracterizeze toate componentele dintr-un proteom complex. Oamenii de știință adoptă o abordare „divide și cucerește” pentru a caracteriza proteomii, prin faptul că încearcă să limiteze temporar numărul de proteine pe care spectrometrul de masă este rugat să le analizeze. Prin răspândirea proteomului, mai multe proteine vor fi analizate în cele din urmă în cadrul unui experiment individual.

pentru a separa proteomii, oamenii de știință au folosit tehnologii electroforetice și cromatografice, separat și în combinație, atât offline, cât și online. Deși aceste eforturi pot duce la separarea și identificarea a mii de proteine, nicio metodă unică nu poate rezolva toate proteinele dintr-un proteom, datorită numărului lor mare și intervalului dinamic al concentrației. Separările cu o singură dimensiune sunt inadecvate pentru rezolvarea eficientă a amestecurilor complexe de proteine. Acest fapt a fost recunoscut în urmă cu peste o jumătate de secol de Smithies și Poulik (1), care au recunoscut că o combinație de două procese electroforetice pe un gel în unghi drept ar trebui să ofere un grad de rezoluție mult mai mare decât este posibil cu oricare separat. Cele două procese electroforetice sunt rezoluția prin dimensiunea moleculară și mobilitatea soluției libere pe un gel de amidon. Predicția lor continuă să fie dovedită adevărată și a constituit baza pentru dezvoltarea metodologiilor multidimensionale ortogonale pentru separarea amestecurilor complexe nu numai prin electroforeză în gel, ci și prin cromatografie și electroforeză capilară.

pentru a înțelege corect progresele făcute în pagina bidimensională (pagina 2D), trebuie să ne întoarcem mult mai departe de un sfert de secol. În 1930 Tiselius a introdus metoda limită în mișcare ca instrument analitic pentru studierea electroforezei proteinelor (2). De la munca sa de pionierat, diferite forme de electroforeză au fost utilizate pentru separarea amestecurilor complexe de proteine, fiecare cu o rezoluție îmbunătățită. Încă din 1962, Raymond și Aurell (3) au demonstrat efectele neliniare semnificative ale concentrației gelului asupra mobilității electroforetice a proteinelor prin utilizarea electroforezei 2-D utilizând diferite concentrații de gel de acrilamidă pentru a separa proteinele serice. Doi ani mai târziu, Raymond (4) a demonstrat superioritatea gelurilor plate în comparație cu gelurile cu tuburi cilindrice. De exemplu, placa plană oferă o suprafață maximă pentru răcirea gelului; modelele rezultate sunt mai ușor de cuantificat în densitometre de înregistrare standard; un număr mare de probe pot fi prelucrate folosind o singură placă de gel, facilitând compararea directă a probelor prelucrate în condiții identice; și, cel mai important, placa plană permite aplicarea separărilor 2-D. Aceste preferințe perspicace s-au dovedit adevărate și sunt practicate astăzi în multe laboratoare bioanalitice.

o altă avansare în separările de gel 2-D a fost introdusă în 1972 de Wright (5), care a folosit o coloană de gel de poliacrilamidă de 4,75% (2% legătură încrucișată) în prima dimensiune, care a fost apoi îndepărtată din cilindrul de sticlă și așezată pe marginea superioară a unei plăci cu gradient de 2%. După electroforeză, placa de gel a fost plasată într-o soluție de colorare, rezultând vizualizarea A 112 proteine serice umane rezolvate.

aceste abordări noi au rezolvat doar un număr mic de proteine, în primul rând cele mai abundente proteine ale unei celule sau proteom seric. Introducerea paginii 2D în 1975 de către O ‘ Farrell (6) pentru separarea proteinelor celulare în condiții de denaturare a permis rezoluția a sute de proteine. Principiul aplicat a fost foarte simplu: proteinele au fost rezolvate pe un gel folosind focalizarea izoelectrică (IEF), care separă proteinele din prima dimensiune în funcție de punctul lor izoelectric, urmată de electroforeză într-o a doua dimensiune în prezența dodecilsulfatului de sodiu (SDS), care separă proteinele în funcție de masa lor moleculară. Metoda lui O ‘ Farrell este cu adevărat baza paginii 2D moderne, care a fost rapid adaptată și acceptată pe scară largă de alți cercetători. Anderson și Anderson (7) au folosit pagina 2D pentru analiza proteinelor plasmatice umane. Ei au fost capabili să separe și să detecteze aproximativ 300 de pete de proteine distincte la colorare. Spre deosebire de O ‘ Farrell, Manabe (8) a separat proteinele plasmatice umane folosind pagina 2D fără agenți de denaturare. Aproximativ 230 de pete proteice au putut fi observate pe gel; cu toate acestea, petele au fost murdare și nu au fost bine rezolvate.

introducerea gradienților de pH imobilizați

după cum s-a menționat mai sus, pagina 2D cuprinde IEF în prima dimensiune, urmată de pagina SDS în a doua dimensiune. De la introducerea sa de către Kolin în 1954 (9), IEF a suferit mai multe progrese. Prima dimensiune se realizează în tije de gel de poliacrilamidă care se formează în tuburi de sticlă sau plastic și conțin amfolite care formează un gradient de pH într-un câmp electric. Aceste tije au fost istoric ireproducibile, instabile și greu de lucrat. Introducerea gradienților de pH imobilizați (IPGs) de Bjellqvist și colab. (10) a avut un impact semnificativ asupra utilizării FEI pentru separarea amestecurilor complexe pe o gamă largă de pH. IPGs a permis formarea de gradienți de pH stabili și reproductibili capabili să concentreze proteinele acide și bazice pe un singur gel preparat cu gradienți de pH largi. În IPGs, amfolitele purtătoare sunt atașate la moleculele de acrilamidă și turnate în geluri pentru a forma un gradient de pH fix. Fixarea gradientului previne deriva în gel și asigură, de asemenea, că acestea pot fi turnate într-un mod eficient și reproductibil. Utilizarea benzilor IPG cu rază îngustă a permis separarea unui număr mai mare de proteine decât a fost posibil cu pagina 2D standard, deoarece un interval de pH mai restrâns a fost răspândit pe o distanță fizică mai mare. Această răspândire a permis separarea proteinelor cu valori similare ale punctului izoelectric (pI) cu rezoluție mai mare. Pentru a ilustra acest punct, Hoving și colab. a dezvoltat o metodă de pagină 2D în care au aplicat benzi IPG cu rază îngustă în prima dimensiune (11). Benzile IPG au fost de obicei 1-3 pH U lățime și s-au suprapus între ele cu cel puțin 0,5 pH U. au fost utilizate șase benzi IPG care acoperă intervalul de pH de la 3,5 la 10. Proteinele dintr-o linie celulară de limfom B au fost aplicate pe fiecare bandă și separate folosind IEF. Fiecare bandă a fost apoi aplicată pe o placă de gel individuală SDS-PAGE și proteinele au fost separate în a doua dimensiune pe baza greutății lor moleculare. Aproximativ 5000 de pete distincte au fost detectate folosind cele șase benzi IPG, comparativ cu 1500 de pete detectate folosind o singură bandă IPG cu un interval de pH de 3-10 și o singură placă standard de gel de 2D. Wildgruber și colab. (12) a comparat utilizarea a 3 benzi IPG cu intervale de pH de 4-5, 5-6 și 5,5–6,7 împotriva gelurilor rulate cu benzi IPG cu intervale de gradient de pH de 3-10 și 4-7. Ei au fost capabili să detecteze 2,3 și 1,6 centi mai multe pete proteice folosind trei benzi IPG cu rază îngustă decât cu cele două benzi IPG cu gradient mai larg (3-10 și, respectiv, 4-7).

în timp ce rezoluția mai mare obținută folosind mai multe IPG-uri înguste suprapuse permite identificarea mai multor proteine, fiecare bandă îngustă necesită o placă de gel separată și o anumită cantitate din aceeași probă care trebuie încărcată pe fiecare. Această cerință înseamnă că, dacă volumul sau concentrația eșantionului este limitată, este posibil ca un astfel de experiment să nu fie posibil. Pentru eșantioane limitate, ar trebui luat în considerare un interval de pH mai larg sau un număr minim de IPG-uri.

diferențială bidimensională în gel electroforeză (2D-DIGE)

obiectivul de separare a proteinelor folosind 2D-PAGE este dublu: (i) identificarea proteinelor noi și (ii) măsurarea abundenței lor relative între probele comparative. Un avantaj al paginii 2D ca tehnică de separare este nu numai că rezolvă un număr mare de proteine, dar colorarea acestor proteine permite cuantificarea abundențelor relative ale proteinelor. De exemplu, proteinele extrase din două probe de ser (sănătoase și bolnave) sunt încărcate fiecare pe o placă de gel separată. După colorare, petele proteice sunt aliniate și scanate pentru a măsura intensitățile lor individuale. În timp ce s-au făcut multe progrese în instrumentele de aliniere software, a fost dificil să se asigure o comparație directă spot-to-spot între două geluri separate. Dezvoltarea electroforezei diferențiale în gel 2 – D (DIGE) în 1997 a depășit această limitare, permițând separarea a până la trei amestecuri de proteine distincte într-un singur gel de pagină 2D (13). Într-un experiment tipic 2D-DIGE, proteinele extrase din trei probe diferite, sănătoase, bolnave și control intern (o probă combinată formată din amestecarea unor cantități egale de proteine extrase din probele sănătoase și bolnave), sunt etichetate covalent, fiecare cu un colorant fluorescent cianinic care are o excitație și o lungime de undă de emisie diferite. Probele sunt potrivite pentru migrare, astfel încât aceeași proteină etichetată cu oricare dintre coloranți va migra în aceeași poziție pe gel. Coloranții de cianină care au fost utilizați sunt: 1-(5-carboxi-pentil)-1′-propilindocarbacianină halogenură n-hidroxizuccinimidil ester (Ci3); 1-(5-carboxipentil)-1′-metilindodicar-bacianină halogenură n-hidroxizuccinimidil ester (Ci5); și 3-(4-carboximetil)fenilmetil-3′-etiloxacarbacianină halogenură n-hidroxizuccinimidil Ester (CI2). Concentrațiile egale ale proteinelor etichetate diferit și proba de control sunt amestecate, aplicate pe o singură placă de gel și separate folosind pagina 2D. Eșantionul de control servește ca standard intern, permițând atât potrivirea inter – cât și intra-gel. Proba de control ar trebui să conțină fiecare proteină prezentă în toate probele dintr-un experiment. Aceasta înseamnă că fiecare proteină din experiment are un semnal unic în standardul intern, care este utilizat pentru comparații cantitative directe în cadrul fiecărui gel și pentru a normaliza valorile cantitative ale abundenței pentru fiecare proteină între geluri. Scanarea gelului la lungimile de undă specifice de excitație ale fiecărui colorant, folosind un imager de fluorescență, permite vizualizarea proteinelor marcate diferențiat (Figura 1). Imaginile sunt apoi îmbinate și analizate folosind software de imagistică, care permite compararea diferențelor dintre nivelurile de abundență ale proteinelor. Valoarea din DIGE elimină orice eroare legată de nealinierea gelului și asigură o cuantificare precisă (14).

proteinele de interes sunt excizate din gel, digerate proteolitic și identificate folosind SM. Deoarece se realizează folosind o singură placă de gel, 2D-DIGE necesită 50% mai puține geluri, făcându-l mai economic și diferențele de exprimare a proteinelor între două probe diferite de proteine mai ușor de comparat și mai precis imaginate. În plus, este necesar mai puțin timp pentru a detecta petele proteice, deoarece reacția de etichetare în DIGE este mai rapidă decât vizualizarea folosind metode de colorare. Atunci când este necesară compararea nivelurilor de expresie a proteinelor din două probe diferite, DIGE este metoda de alegere (15).

punctele forte și punctele slabe ale paginii 2D

electroforeza este o tehnică consacrată care a suferit mai multe progrese care au îmbunătățit rezoluția, detectarea, cuantificarea și reproductibilitatea. Abordările 2-D SDS-PAGE și 2D-DIGE pentru profilarea proteinelor sunt metode accesibile și economice care posedă o putere mare de rezolvare și permit detectarea a sute de proteine pe o singură placă de gel. Deși reproductibilitatea a fost o problemă cu pagina 2D, mai ales atunci când se profilează două amestecuri de proteine, a fost mult îmbunătățită prin utilizarea 2D-DIGE. Rezoluția a fost îmbunătățită prin introducerea IPGs, care permite analistului să adapteze gradientul de pH pentru rezoluție maximă folosind geluri ultrazoom cu un interval îngust de gradient de pH. Cu pagina 2D modernă, nu este neobișnuit să se rezolve două proteine care diferă în pI cu 0,001 U.

deși pagina 2D a fost limitată de incapacitatea sa de a rezolva proteinele prea bazice sau prea acide, prea mari sau prea mici, această limitare scade continuu. De exemplu, separarea proteinelor de bază poate fi analizată utilizând IPGs în intervalul de pH 4-12. Știința separării evoluează întotdeauna și nu va dura mult până când problemele rămase de electroforeză în gel vor fi rezolvate în mod adecvat.

introducerea 2D-DIGE a contribuit enorm la rezolvarea problemelor de reproductibilitate și cuantificare. Utilizarea imaginilor și a computerelor permite nu numai extragerea rapidă a datelor, achiziția și analiza, ci și detectarea la fața locului, normalizarea, profilarea proteinelor, corectarea fundalului și raportarea și exportul de date. Ca tehnică de separare, detectare și cuantificare, 2D-DIGE este un instrument important, în special pentru laboratoarele clinice implicate în determinarea nivelurilor de expresie a proteinelor și descoperirea biomarker-ului bolii. Când variația biologică absolută între probe este obiectivul principal, ca în descoperirea biomarker, 2D-DIGE este metoda de alegere.

deși s-au înregistrat progrese semnificative în metodele nongel (sau bazate pe soluții) pentru cuplarea metodelor de fracționare direct online cu analiza MS, 2D-PAGE a rămas o tehnică populară pentru efectuarea studiilor proteomice. Deși pagina 2D, ca orice schemă de fracționare, are avantajele și dezavantajele sale, nu există nici o îndoială că va rămâne o tehnică esențială pentru caracterizarea proteomilor pentru mulți ani care vor veni.