Un model bazat pe Reguli al căii de semnalizare a insulinei

modelul căii de semnalizare a insulinei

pornind de la trei modele publicate , am implementat modelul ISP așa cum este descris în Fig. 1 folosind notația grafică a biologiei sistemelor .

modelul cuprinde multe dintre elementele esențiale responsabile de acțiunea insulinei, deoarece sunt incluse cele trei sub-căi majore ale ISP, descrise pe scurt în cele ce urmează.

calea PI3K-AKT

pentru calea PI3K-Akt, ne referim mai ales la modelul din Sedaghat și colab. . Modelul a fost utilizat de mai multe grupuri de cercetare și include multe dintre cele mai cunoscute componente de semnalizare care mediază translocarea transportorului de glucoză GLUT4. Acestea includ subsistemele de legare și reciclare a receptorilor de insulină; subsistemul de semnalizare post-receptor incluzând atât fosforilarea Ser – cât și Tyr la substratul receptorului de insulină1( IRS1); formarea unui complex (complexul IRS1_PI3K) între irs1 fosforilat și fosfatidilinozitida 3-kinază(PI3K); fosfatidilinozitolul 3,4,5-trisfosfații PI (3,4,5)P3, sinteza; fosforilarea protein kinazei B (AKT) și a protein kinazei C (PKC)-XV; translocarea GLUT4 în membrana plasmatică. Efectele proteinei tirozin fosfatazei (PTP1B) și fosfatazelor lipidice (SHIP2 și PTEN) sunt, de asemenea, luate în considerare în model.

calea TSC1/2-mTOR

pentru calea TSC1/2-mTOR ne referim mai ales la modelul publicat recent în Sonntag și colab. , descriind efectul mTOR ca răspuns la insulină și aminoacizi. Modelul ia în considerare ambele complexe mTOR: mTORC1 și mTORC2. activarea mTORC1 depinde de prezența aminoacizilor și este inhibată de activarea proteinelor sclerozei tuberoase 1 și 2 (TSC1/2) (adică fosforilarea Ser), care, la rândul său, depinde de activarea protein kinazei (AMPK) activată de 5′ AMP. Activarea AMPK depinde de fosforilarea Irs1 Tyr, în timp ce inhibarea TSC1/2 (adică fosforilarea Tyr) depinde de fosforilarea AKT la Thr309. mTORC2, care a fost identificat recent ca fiind proteina kinaza 2 (PDK2) dependentă de fosfoinozitidă, adică. kinaza responsabilă de fosforilarea Ser474 Akt contribuie la fosforilarea dublă AKT împreună cu fosforilarea Thr309, operată de proteina kinaza 1 dependentă de fosfoinozitidă (PDK1). Sonntag și colab. formulați ipoteza prezenței unei variante PI3K, care este reglată direct de receptorul de insulină activat și, la rândul său, activează mTORC2. Am inclus această ipoteză în modelul nostru.

calea RAS-MAPK

pentru calea RAS-MAPK, ne referim mai ales la modelul din Borisov și colab. , descriind atât EGF, cât și stimulările insulinei. Modelul include toate mecanismele chimice principale implicate în calea RAS-MAPK: interacțiunea IRS fosforilat Tyr 1 cu SHP2 (proteina kinaza tirozină care conține domeniul SH2) și complexul GRB2-SOS (receptorul factorului de creștere legat 2 și complexul son of sevenless), formând astfel complexele SHP2-IRS1 și GRB2/SOS-IRS1, respectiv; legarea GTP a RAS; fosforilarea serinei proto-oncogene RAF/treonin-protein kinază (c – RAF); interacțiunea receptorului de insulină cu proteina Activatoare Ras GTPase (RASGAP), care la rândul său catalizează procesul invers al dezactivării Ras; activarea SRC proto-oncogen tirozin-protein kinazei care activează pe deplin c-RAF; specificitatea duală a kinazei activate de mitogen 1/2 (MEK1/2); kinazele reglate de semnalul extracelular (ERK1/2).

integrarea căilor PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR și RAS-MAPK

căile PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR și RAS-MAPK conțin mai multe părți suprapuse, care, în documentele originale, au fost adesea modelate în moduri diferite, bazându-se pe ipoteze ușor diferite. Am comparat reacțiile suprapuse între diferite modele și am implementat cea mai actualizată versiune a acestora pe baza cunoștințelor actuale despre biochimia celulară. Mai mult, integrarea celor trei modele a necesitat tratarea diferitelor unități de măsură adoptate pentru a descrie variabilele de stare. În timp ce experimentele imunoblot permit obținerea de informații importante cu privire la intervalul de timp al evenimentelor de semnalizare, informațiile cantitative despre expresia proteinelor sunt adesea problematice de recuperat, astfel încât profilurile de concentrație prezise sunt uneori raportate în concentrație micromolară, ca în Borisov și colab. , sau în unități arbitrare (AU), ca în Sonntag și colab. . În schimb, în Sedaghat și colab. , concentrația a fost exprimată fie în unități molare, fie în procente din concentrația totală (de exemplu, concentrația de GLUT4 citosol a fost considerată a fi 96% din concentrația totală de GLUT4 din celulă la starea inițială).

potențial, RBM permite efectuarea atât a simulărilor deterministe, cât și a celor stochastice, cu condiția ca cantitățile variabile să fie exprimate în copii ale moleculelor pe celulă. Chiar dacă în lucrarea de față nu am folosit simularea stocastică, am aliniat toate variabilele la aceeași unitate, adică. numărul de molecule pe celule, prin înmulțirea unităților molare cu NA * V (NA indică numărul Avogadro și V volumul celulei, considerat egal cu 3e-12 l). Toate detaliile despre conversia unității Din au și concentrațiile procentuale sunt date în Material și metode.

modelul rezultat constă din 42 de reguli de reacție și 101 parametri care codifică interacțiunile dintre 61 de specii chimice distincte. Reacțiile, valorile parametrilor și condițiile inițiale sunt toate raportate în fișierul suplimentar 1.

noutăți ale modelului RBM-ISP

implementarea RBM a facilitat contabilizarea unui număr de caracteristici ale ISP, cum ar fi fosforilarea proteinelor de semnalizare în mai multe locuri și cu efecte multiple, interacțiunea simultană a moleculelor cu diferiți parteneri de legare și localizarea subcelulară a unor reacții. Caracteristicile enumerate mai sus sunt discutate în detaliu în cele ce urmează.

fosforilarea proteinelor de semnalizare pe mai multe situsuri

moleculele de semnalizare pot avea niveluri diferite de activitate, în funcție de reziduurile fosforilate. Luați în considerare, de exemplu, IRS1 și AKT. IRS1 are multe reziduuri potențial implicate în modificări post-translaționale și poate fi activat sau inhibat în acțiunea kinazei, în funcție de reziduul fosforilat fiind Tyr sau Ser . De exemplu, fosforilarea Tyr-896 este necesară pentru legarea PI3K, SHP2 și GRB2, în timp ce fosforilarea Ser-636 de către p70S6K este un mecanism legat de rezistența la insulină . AKT, în schimb, poate fi activat prin fosforilare la Thr309 sau Ser474 de către PDK1 și mTORC2, respectiv .

activarea/inhibarea dependentă de fosforilare IRS1 a fost deja inclusă în modelul Sedeghat, deși se ia în considerare fosforilarea Ser reglementată de PKC și nu de p70S6K, ca în modelul Sonntag. Aici am modelat atât acțiunile PKC , cât și p70s6k și am descris formarea/disocierea complexă pIRS1-Tyr896 cu PI3K, SHP2 și GRB2 .

cele două situsuri de fosforilare ale AKT nu au fost modelate în mod explicit în Sedaghat și colab. . Am modelat fosforilarea AKT la Thr mediată de PI(3,4,5)P3 ca în Sedaghat și colab. modelul și fosforilarea AKT la Ser mediată de mTORC2 ca în Sonntag și colab. model și presupus:

i)
AKT fosforilat fie la Thr, fie la ambele situsuri pentru a acționa asupra complexului TSC1 / 2 prin medierea fosforilării sale la Tyr și defosforilarea la Ser ;
ii)
fosforilarea AKT în Ser sau în ambele locuri pentru a inactiva C-RAF ;
iii)
fosforilarea AKT fie la Thr, fie la Ser pentru a activa translocarea GLUT4 .

interacțiunea cu mai mulți parteneri de legare

interacțiunea moleculelor din căile de semnalizare cu numeroși parteneri de legare diferiți are ca rezultat formarea potențială a diferitelor complexe. În ISP, IRS1 fosforilat la Tyr-896 se poate lega PI3K așa cum este modelat în Sedaghat și colab. sau GRB2 / SOS și SHP2, după cum este modelat în Borisov și colab. . Pentru a corespunde specificației modelului RBM-ISP cu cunoștințele actuale, am permis formarea diferitelor complexe. Astfel, IRS1 se poate lega într-un mod reciproc exclusiv GRB2/SOS și SHP2, dar poate lega simultan GRB2/SOS și subunitatea de reglementare p85 a PI3K .

informații despre localizarea subcelulară în regulile de reacție

posibilitatea ca proteinele să interacționeze este adesea legată de localizarea lor fizică, adică prezența lor în spațiul extra-celular, citoplasmă, nucleu, membrană plasmatică etc. De exemplu, lipidele PI (3,4,5) P3 funcționează ca locuri de andocare a membranei plasmatice care recrutează diferite proteine care conțin domenii de omologie pleckstrin (PH) (de ex. AKT și PDK1) și co-localizarea acestora pot accelera anumite evenimente de semnalizare . Un alt exemplu este interacțiunea mTORC1 cu omologul Ras îmbogățit în creier (RHEB) și familia Rag pe membrana lizozomului, raportat de Zoncu și colab. . În modelul nostru, am inclus informații despre localizarea subcelulară pentru receptorul de insulină și transportorul GLUT4, făcând distincția între localizarea lor plasmatică și citoplasmatică conform descrierii matematice date de Sedaghat și colab. .

predicții Model

profilurile de concentrație ale tuturor speciilor chimice care populează modelul au fost simulate la stimularea insulinei de 60 min, 100 nM. Concentrația de 100 nM reprezintă un nivel bine acceptat de stimulare a insulinei în culturile celulare frecvent întâlnite în literatura de specialitate și utilizate, de asemenea, de grupul nostru . Potrivit lui Sonntag și colab. , am presupus, de asemenea, o stimulare constantă a aminoacizilor, necesară pentru a obține activarea mTORC1 și feedback-ul p70S6K pe IRS1. Pentru a evalua fiabilitatea modelului, predicțiile modelului au fost comparate cu datele experimentale disponibile în setul nostru de date pentru unele fosfoproteine la 2, 5, 10, 30 și 60 de minute după insulină plus aminoacizi, adică leucină, stimulare . Așa cum se arată în Fig. 2, profilurile experimentale și prezise ale pAKT-s473 și pmTORC1-s2448 sunt în acord, deoarece ambele prezintă un model de fosforilare în creștere care atinge o stare de echilibru în primele 2-5 minute și, respectiv, 20-30 minute. Profilul prezis pentru ppERK1 / 2-Y202,Y204 este confirmat de datele experimentale în primele 10 minute, în timp ce în ultimele puncte de timp scade rapid în datele experimentale în ceea ce privește predicțiile modelului. Profilul observat în datele experimentale pentru ppERK1/2-Y202,Y204, ar putea fi mai strâns corelat prin creșterea puterii feedback-ului între ppERK1/2-Y202,Y204 și GRB2/SOS. În Fig. 2 (panoul din dreapta sus, linie punctată), este prezentat profilul simulat al ppERK1/2-Y202,Y204 obținut prin înmulțirea parametrului kcat39 (Vezi fișierul suplimentar 1) cu un factor de 10. Rețineți că în modelul ISP RBM disponibil online, am decis să lăsăm parametrul modelului neschimbat, adică folosim valoarea din literatură , amânând optimizarea parametrilor pentru studii viitoare, când vor fi disponibile date suplimentare. Din păcate, datele experimentale ale pP70S6K-T389 nu au fost fiabile (doar o singură replică disponibilă), deci nu putem compara profilurile experimentale și simulate pentru această proteină, care este un punct final al căii cu o acțiune importantă de feedback asupra IRS1. Cu toate acestea, profilul simulat prezentat în Fig. 2 (panoul inferior, dreapta) seamănă cu datele experimentale prezentate în alte lucrări .

am examinat profilurile prezise ale tuturor speciilor active și le-am grupat în patru clustere în funcție de comportamentul lor dinamic, așa cum se arată în Fig. 3:

răspuns rapid, atingând starea de echilibru în decurs de 2-5 minute (albastru)
răspuns rapid de depășire, atingând vârful în 2-5 min și apoi starea de echilibru după 10-20 min (verde)
răspuns lent, atingând starea de echilibru în 10-20 min (portocaliu)
răspunsuri lente de depășire, atingând vârful în 5-10 minute și starea de echilibru în 30-60 minute (violet).

după stimularea insulinei, receptorul insulinei răspunde rapid prin fosforilarea și declanșarea unei cascade de evenimente de-a lungul căilor distincte. De-a lungul căii PI3K – AKT, toate mecanismele strâns legate de fosforilarea Irs1 Tyr sunt caracterizate printr-un răspuns rapid. Același lucru este valabil și pentru alte ținte directe ale irs1 fosforilate la Tyr de-a lungul cascadei TSC1/2-mTOR, adică fosforilarea AMPK la formarea complexelor t172, SHP2-IRS1 și GRB2/SOS-IRS1. Răspunsul rapid se caracterizează fie printr-o creștere rapidă la starea de echilibru, fie printr-o depășire tranzitorie urmată de starea de echilibru, în funcție de absența/prezența mecanismelor de feedback care acționează asupra moleculei țintă (cazul 1 și 2, respectiv albastru și verde, în Fig. 3). Mecanismele care constituie în cea mai mare parte calea TSC1/2-mTOR și care joacă un rol în Ser – fosforilarea IRS1 sunt caracterizate printr-un răspuns relativ lent de depășire (cazul 3, portocaliu în Fig. 3). După cum s-a observat mai sus, calea RAS-MAPK presupune în componentele sale din amonte un răspuns rapid, care devine vizibil mai lent pentru cele din aval (cazul 4, Violet în Fig. 3).

în general, moleculele din aval de cale, legate de procese relativ lente, cum ar fi activarea transcripției sau interacțiunea cu mediul din afara celulei, cum ar fi ERK1/2 și GLUT4, sunt caracterizate de un răspuns lent, în timp ce moleculele din amonte de cale sunt caracterizate de un răspuns rapid, astfel încât să provoace o propagare rapidă a semnalului. În acest context, răspunsul la depășire urmat de revenirea la starea de echilibru ar putea contribui la realizarea unei propagări rapide a semnalului pe o cale de semnalizare, făcând moleculele din nou disponibile pentru alte căi de semnalizare imediat după.

predicții Model în absența mecanismelor de control

au fost apoi efectuate o serie de simulări pentru a investiga robustețea sistemului asupra a două efecte țintă ale ISP: translocarea GLUT4 și fosforilarea ERK1/2. În special, a fost analizat rolul a două mecanisme majore de control în reglarea efectelor țintă:

p70s6k-IRS1 buclă de feedback negativ (linia roșie din Fig. 1);
bucla de feedback negativ ERK1/2-GRB2/SOS (linia albastră din Fig. 1);

în acest scop, a fost comparat cursul de timp al răspunsului GLUT4 și ERK1/2 în prezența și absența celor două mecanisme de reglementare enumerate mai sus (Fig. 4). Dinamica ERK1 / 2 dublu fosforilat este puternic afectată atât de buclele de feedback negativ P70S6K-IRS1, cât și de erk1/2-GRB2/SOS. Pe de altă parte, starea de echilibru și comportamentul dinamic al GLUT4 în membrană nu sunt afectate de ERK1/2, dar sunt puternic afectate de bucla de feedback negativ P70S6K-IRS1, confirmând astfel importanța remarcabilă a acestui din urmă mecanism de control în determinarea dinamicii sistemului.

este bine cunoscut faptul că rezistența la insulină este asociată cu defecte ale semnalizării dependente de IRS, implicând dereglarea acesteia în inițierea și progresia bolii metabolice. O viziune emergentă este că reglarea pozitivă/negativă a IRS prin căi autologe este subminată în boală prin creșterea fosforilărilor bazale și a altor serine / treonine inadecvate temporar , care duc la o absorbție redusă a glucozei. Hiperinsulinemia compensatorie poate crește în acest moment și poate duce, în cele din urmă, la diabet. Deși IRS1 (și IRS2) sunt reglate printr-un mecanism complex care implică fosforilarea a peste 50 de reziduuri diferite de serină/treonină, în modelul nostru p70s6k-irs1 bucla de feedback negativ pare esențială pentru un bun control al absorbției glucozei. Îmbunătățirea buclei de feedback negativ P70S6K-IRS1 este capabilă să explice o sensibilitate redusă la insulină și absorbția glucozei (Fig. 5). În mod similar (deși ipotezează, de asemenea, un feedback pozitiv de la mTOR la un reziduu de serină IRS1 diferit), br Inktiktnnmark și colab. , folosind un model minim de semnalizare a insulinei, arată că un mecanism de feedback pozitiv scăzut este capabil să explice o absorbție redusă a glucozei.

pe de altă parte, ambele bucle de feedback negativ P70S6K-IRS1 și ERK1/2-GRB2/SOS par esențiale pentru a garanta că ERK dublu fosforilat prezintă un comportament tranzitoriu, cu un vârf la 10 min urmat de o revenire la starea inițială. Acest comportament a fost deja raportat în literatura de specialitate la stimulul insulinic și la stimulul factorului de creștere epidermal . Un răspuns Erk tranzitoriu previne o activare susținută a ERK care ar duce la proliferarea continuă a celulelor .

analiza sensibilității

pentru a investiga în continuare rolul celor două mecanisme majore de control în reglarea efectelor țintă, analiza sensibilității locale a fost realizată prin aplicarea unei mici perturbații (0.1% din valoarea parametrului) la un parametru model la un moment dat și evaluarea modificărilor relative rezultate ale translocării GLUT4 și fosforilării ERK1/2 (vezi metode). Tabelele 1 și 2 prezintă coeficienții de sensibilitate ai parametrilor modelului, clasificați în funcție de valoarea lor absolută și comparați cu valoarea pe care coeficienții o presupun la îndepărtarea buclelor de feedback negativ P70S6K-IRS1 și ERK1/2-GRB2/SOS. Acești coeficienți măsoară efectul general, adică în timpul ferestrei de observare, al unei modificări a parametrilor asupra rezultatului, adică răspunsul GLUT4 și ERK. Valorile pozitive / negative înseamnă că creșterea valorii parametrului are ca efect îmbunătățirea / reducerea răspunsului. Deoarece valorile absolute mici înseamnă că modificările parametrilor nu afectează în mod semnificativ rezultatul, în tabelele 1 și 2, sunt raportate doar coeficienți mai mari de 0,1 % (valoare absolută), fie în modelul original, fie în cel modificat.

Tabelul 1 Analiza parametrică a sensibilității modelului complet pentru translocarea membranei GLUT4

Tabelul 2 Analiza parametrică a sensibilității modelului complet pentru activarea ERK1/2

analiza parametrică a sensibilității modelului complet pentru răspunsul GLUT4 relevă faptul că parametrii cei mai sensibili sunt legați de translocarea GLUT4 la membrana plasmatică, urmată de cei legați de formarea lipidelor și formarea/disocierea complexului IRS1_PI3K. Absența feedback-ului p70S6K_IRS1 are un impact puternic asupra creșterii sensibilității (valoare absolută) a parametrilor legați de formarea lipidelor și formarea/disocierea complexului IRS1_PI3K.

parametrii legați de fosforilarea/defosforilarea irs1 la Tyr/Ser, au o sensibilitate mai mică, care se diminuează (valoare absolută), în general, prin eliminarea feedback-ului P70S6K-IRS1, cu excepția parametrului k7p, legat de fosforilarea IRS1 la Ser. Parametrii legați de fosforilarea irs1 mediată de PKC la Ser arată, de asemenea, valori crescute după eliminarea feedback-ului P70S6K-IRS1. Deoarece eliminarea feedback-ului ERK1/2-GRB2/SOS nu are niciun efect asupra translocării GLUT4, coeficienții de sensibilitate nu se modifică cu și fără acest feedback.

analiza parametrică a sensibilității modelului complet pentru răspunsul ERK1/2 arată că parametrii cei mai sensibili sunt legați de activarea RAS, MEK și RAF și de fosforilarea IRS1 la Tyr și Ser, aceasta din urmă mediată de p70S6K.de-a lungul căii PI3K-AKT și RAS-ERK1/2, feedback-ul ERK1/2-GRB2/SOS pare să aibă un rol important în robustețea sistemului. Dinamica sistemului este slab afectată de absența acestuia (vezi Fig. 4), în timp ce sensibilitatea parametrului crește (în valoare absolută) în aproape toate cazurile dacă acest feedback este eliminat.

concluziile privind efectul feedback-ului P70S6K-IRS1 asupra răspunsului ERK1/2 sunt mai controversate. Eliminarea acestui feedback are ca efect reducerea sensibilității parametrilor de-a lungul căii PI3K_AKT, în timp ce, de-a lungul căii RAS-ERK1/2, nu are aproape niciun efect pentru parametrii legați de fosforilarea MEK, inactivarea RAF și fosforilarea ERK. Diminuează sensibilitatea pentru parametrii legați de RAS, activarea RAF și la perturbarea complexului IRS1-GRB2/SOS și IRS1-SHP2. Crește puternic sensibilitatea parametrilor legați de activarea SRC și RAF.

aceste rezultate evidențiază rolul central al buclelor de feedback negativ în determinarea nu numai a dinamicii unui sistem biologic, ci și a robusteții acestuia. Această proprietate are o importanță remarcabilă, deoarece păstrează comportamentul dinamic al sistemului împotriva zgomotului și a micilor fluctuații biologice datorate în mod obișnuit variabilității intercelulare.