faktorer som binder till pro-COL1A2 proximal promotor
flera funktionella cis-verkande element har identifierats i den proximala 400-bp-promotorn för musen pro-Col1a2-genen (154-2350 bp) och den mänskliga minimala sekvensen mellan 152 och 2378 bp. Den första transkriptionsfaktorn som befanns binda till denna promotor var det allestädes närvarande CCAAT-bindande proteinet CBF. Denna transkriptionsfaktor bildas av tre separata underenheter, namngivna A, B och C, som alla har klonats och sekvenserats (Maity och de Crombrugghe, 1998). Alla tre subenheter behövs för att CBF ska binda till sekvensen som innehåller ccaat-rutan mellan 284 och 280 och aktivera transkription i både mänskliga och musgener (se Fig. 13.2 B). In vitro-data tyder på att A–och C-subenheterna först associerar för att bilda ett A-C-komplex och att detta komplex sedan bildar en heteromerisk molekyl med B-subenheten (Sinha et al., 1995). Mutationer i ccaat-rutan som förhindrar bindning av CBF minskar transkriptionsaktiviteten hos pro-Col1a2 proximal promotor tre till fem gånger i övergående transfektionsexperiment av fibroblastiska cellinjer (Coustry et al., 1995). Renad CBF såväl som CBF som består av dess tre rekombinanta underenheter aktiverar också Pro-Col1a2-promotorn i cellfria nukleära extrakt som tidigare tömts av CBF (Coustry et al., 1995). Två av de tre underenheterna i CBF innehåller transkriptionsaktiveringsdomäner. På senare tid föreslog en enda substitution av T till en A in vivo i närvaro av en uppströms förstärkare av den mänskliga sekvensen att CBF är involverad i mönstring av kollagen typ I-uttrycket i dorsoventral såväl som rostrocaudalaxeln hos mushudfibroblaster (Tanaka et al., 2004).
förutom bindningsstället för CBF identifierade fottryckningsexperiment och gel-shift-studier andra bindningsställen i den första 350 bp av mouse pro-Col1a2-promotorn. Tre GC-rika sekvenser, belägna vid cirka 2160 bp (mellan 2176 och 2152 bp) och 2120 bp (mellan 2131 och 2114 bp) har visat sig interagera med DNA-bindande proteiner genom fotavtrycksexperiment och gel-shift-analyser (Hasegawa et al., 1996). En radering i muspromotorn som omfattar dessa tre fottryckta sekvenser avskaffade fullständigt transkriptionsaktiviteten hos pro-Col1a2 proximal promotor i övergående transfektionsexperiment med fibroblastiska cellinjer. Motsvarande regioner i den humana Pro-COL1A2-promotorn skyddades också i in vivo och in vitro fottryckningsexperiment (Ihn et al., 1996) och bundna transkriptionsaktivatorer. Gel-shift-analyser utförda med användning av human pro-COL1A2-promotorn har dock föreslagit att ett cis-verkande element beläget vid 2160 bp representerar ett repressorelement (Ihn et al., 1996), vilket innebär att interaktioner mellan proteiner som interagerar med aktivatorelementen vid 2300, 2125 och 280 bp och proteiner som binder till ett repressorelement vid 2160 bp reglerar denna gen. På senare tid visades det att CUX1, ett ccaat-förskjutningsprotein, är associerat med reducerat uttryck av typ i-kollagen både in vivo och in vitro och att förbättring av uttrycket av CUX1 resulterar i effektiv undertryckning av typ i-kollagen genom att störa CBF-bindning (Fragiadaki et al., 2011).
Sp1 och Sp3 har visat sig binda tcctcc-motivet mellan 2123 och 2128 bp; båda transkriptionsfaktorerna aktiverar denna promotor (Ihn et al., 2001) (se Fig. 13.2 B). Vidare binder proteiner som binder till de två proximala segmenten också till det mest uppströms GC-rika segmentet, vid 2300 bp, med undantag för CBF, vilket tyder på en redundans bland funktionellt aktiva DNA-segment av pro-COL1A2 proximal promotor.
TGF Macau förmedlar sin verkan i den mänskliga promotorn genom kombinationen av den allestädes närvarande transkriptionsfaktorn Sp1, Smad3/4-komplexet och koaktiverarna p300 / CREB-bindande protein (CBP) i vad som kallas ett TGF-Tuberkulosresponsivt element (T., 2000). Detta segment innehåller tre GC-rika motiv mellan 2330 och 2255, som kan binda Sp1, CCAAT/förstärkare-bindande protein (C/EBP), aktivatorprotein 1 (AP1) och Smad-komplex (Chen et al., 1999, 2000a, b; Kanamaru et al., 2003; Tamaki et al., 1995; Zhang et al., 2000). Interaktion mellan dessa kärnfaktorer är synergistisk och kräver bindning av Sp1 och Smad3/4 till de GC-rika elementen respektive nedströms Cagac Smad-platsen (Ghosh et al., 2000; Poncelet och Schnaper, 2001; Zhang et al., 2000). Vid sekelskiftet var det en stor debatt om huruvida Smads är viktigare än AP1 i den proximala promotorn. Detta löstes cirka 10 år senare när det visades att TGF-exporten också aktiverar COL1A2-genen via en icke-kanonisk (Smad-oberoende) signalväg, vilket kräver förstärkare/promotorsamarbete som involverar utbyte av C-Jun/JunB transkriptionsfaktor beläggning av en kritisk förstärkarplats, vilket resulterar i stabilisering av förstärkare/promotorkoalescens (Ponticos et al., 2009). En rapport som undersöker effekterna av hypoxi och TGF-Marockos på COL1A2-genen har lagt till Smads potentiella roll, särskilt Smad3, vid reglering av kollagenuttryck. Dessa studier i humana mesangiala celler tyder på att under hypoxiska förhållanden och i närvaro av TGF 2i kan hypoxiinducerbar faktor 1 1ib (HIF-1ib) och Smad3 bilda transkriptionskomplex och företrädesvis förbättra bindningen till ett av de tre hypoxiresponselementen i den humana COL1A2-promotorn vid position -335 bp (Baumann et al., 2016). Författarna föreslår att denna nya interaktion ger en mekanism som redogör för den synergi som observerats mellan HIF och TGF Kazaki vid njurfibros.
TNFa och interferon-GHz (IFN-IE) undertrycker matrisproduktionen. Till skillnad från det enda DNA-elementet som medierar TGF-stimulering av den proximala promotorn COL1A2, har både TNFa och IFN-GHz visat sig hämma COL1A2-transkription genom att störa bildandet av det TGF-inducerade komplexet av TGF och genom att stimulera interaktionen mellan negativa faktorer med responsiva DNA-element som ligger 5′ och 3′ av det. Detta så kallade ”cytokinresponsiva element” spelar en viktig roll för att upprätthålla homeostas. Inblandning av AP1 och NF-kB vid transducering av den hämmande verkan av TNFa på COL1A2-genuttryck har visats med användning av odödliga fibroblaster från möss som saknar antingen AP1-aktivatorn Jun N-terminal Kinas 1 (JNK1) eller NF-kB essentiell modulator NEMO. Specifikt förhindrade förlusten av JNK1 TNFa-antagonismen av TGF bisexuell, men bevarade TNFa-hämning av konstitutivt COL1A2-uttryck. TGF-antagonism av TNFa innefattar jnk1-fosforylering av c-jun, vilket leder till off-DNA-konkurrens av den senare molekylen för Smad3-bindning till det kognata DNA-stället och/eller för interaktion med p300/CBP-koaktivatorer (Kouba et al., 1999; Verrecchia et al., 2001, 2002).
bindningen av IFN-Macau till dess receptorer leder till tyrosinfosforylering av januskinas (JAK) tyrosinkinaser och detta resulterar i sin tur i signalomvandlare och aktivator för transkription (STAT1) fosforylering. I COL1A2 resulterar stat1-aktivering i konkurrens med Smad3 för interaktion med p300/CBP (Inagaki et al., 2003). Dessutom kan JAK1 också aktivera transkriptionsfaktor y-box-bindningsfaktor (YB-1); denna aktivering resulterar i både inhibering av konstitutiv promotoraktivitet genom YB-1-bindning av 2125tc-rutan och antagonism av TGF-Tuberkulosignaler genom YB-1-tävling med Smad3 och/eller p300/CBP (Ghosh et al., 2001; Higashi et al., 2003). För mer information, se ”tillväxtfaktorer” och ” cytokiner.”
Est1 / Fli1 har också visat sig binda samma sekvens med motsatta effekter på kollagen typ i transkription. En funktionell ETS-transkriptionsfaktor identifierades i COL1A2 i närheten av Sp1-platser. Ets1 stimuleras, medan Fli1 hämmade, promotor aktivitet. Sp1-bindning var nödvändig för hämning av Fli1. Dessutom ledde överuttryck av Fli1 i dermala fibroblaster till en minskning av COL1A2 mRNA och proteinnivåer (Czuwara-Ladykowska et al., 2001). Vidare leder TGF-Bronkialbehandling av dermala fibroblaster till dissociation av Ets1 från CBP / p300-komplexen och förändrar deras svar på TGF-exporten till förmån för matrisnedbrytning (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).
dessutom har ett CPG–motiv vid 17 bp visat sig företrädesvis metyleras och binds av RFX-proteiner i celler som förvärvar ett kollagen I-negativt tillstånd. Celltransfektionsexperiment i samband med DNA-bindande analyser har tilldelat positiva eller negativa egenskaper till var och en av proteinerna som binder till den proximala promotorn av pro-COL1A2 (Sengupta et al., 2002). Graden av metylering vid 17 CpG-stället har å andra sidan visat sig modulera bindningsaffiniteten hos RFX-proteiner och följaktligen deras förmåga att nedreglera promotoraktivitet genom att rekrytera associerade proteiner som stör sammansättningen av positivt verkande transkriptionskomplex (Xu et al., 2003, 2004).