En regelbaserad modell av insulinsignalväg / BMC-systembiologi

modellen för insulinsignalväg

med utgångspunkt från tre publicerade modeller implementerade vi modellen för ISP som avbildad i Fig. 1 Använda grafisk Notation för SystemBiologi .

modellen består av många av de väsentliga elementen som är ansvariga för insulinverkan eftersom de tre huvudsakliga delvägarna för ISP, som kort beskrivs i följande, ingår.

PI3K-AKT-vägen

för PI3K-Akt-vägen hänvisar vi mest till modellen i Sedaghat et al. . Modellen har använts av flera forskargrupper och innehåller många av de mest kända signalkomponenterna som förmedlar translokationen av glukostransportör GLUT4. Dessa inkluderar delsystemen insulinreceptorbindning och återvinning; delsystemet postreceptorsignalering inklusive både Ser – och Tyr – fosforylering vid insulinreceptorsubstratet1 (IRS1); bildandet av ett komplex (IRS1_PI3K-komplex) mellan fosforylerat IRS1 och fosfatidylinositid 3-Kinas (PI3K); fosfatidylinositol 3,4,5-trisfosfat PI (3,4,5) P3, syntes; fosforylering av proteinkinas B (AKT) och proteinkinas C (PKC)-aug.; translokation av GLUT4 till plasmamembranet. Proteintyrosinfosfatas (PTP1B) och lipidfosfataser (SHIP2 och PTEN) effekter beaktas också i modellen.

TSC1/2-mTOR-vägen

för TSC1/2-mTOR-vägen hänvisar vi mest till modellen som nyligen publicerades i Sonntag et al. , som beskriver mTOR-effekten som svar på insulin och aminosyror. Modellen tar hänsyn till båda mTOR-komplexen: mTORC1 och mTORC2. mTORC1-aktivering är beroende av närvaron av aminosyror och hämmas av de tuberösa sklerosproteinerna 1 och 2 (TSC1/2) aktivering (dvs ser-fosforylering), som i sin tur beror på 5′ AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK) aktivering. AMPK-aktivering beror på IRS1 Tyr-fosforylering, medan TSC1 / 2-hämning (dvs. Tyr-fosforylering) beror på AKT-fosforylering vid Thr309. mTORC2, som nyligen identifierades som det okända fosfoinositidberoende proteinkinas 2 (PDK2), dvs. kinaset som är ansvarigt för SER474-fosforylering av AKT bidrar till dubbel fosforylering av AKT tillsammans med thr309-fosforylering, som drivs av fosfoinositidberoende proteinkinas 1 (PDK1). Sonntag et al. formulera hypotesen om närvaron av en PI3K-variant, som regleras direkt av den aktiverade insulinreceptorn och aktiverar i sin tur mTORC2. Vi inkluderade denna hypotes i vår modell.

RAS-MAPK-vägen

för RAS-MAPK-vägen hänvisar vi mest till modellen i Borisov et al. , som beskriver både EGF och insulinstimuleringar. Modellen innehåller alla de viktigaste kemiska mekanismerna som är involverade i RAS-MAPK-vägen: interaktionen mellan Tyr-fosforylerad IRS1 och SHP2 (SH2-domäninnehållande tyrosinproteinkinas 2) och GRB2-SOS-komplexet (tillväxtfaktorreceptorbunden 2 Och son of sevenless complex), vilket bildar SHP2 – IRS1 respektive GRB2/SOS-IRS1-komplexen; GTP-bindningen av RAS; fosforyleringen av RAF-proto-onkogenserin/treonin-proteinkinas (C-RAF); interaktionen mellan insulinreceptorn och Ras Gtpas-aktiverande protein (RASGAP), som i sin tur katalyserar den omvända processen för Ras-deaktivering; aktiveringen av proto-onkogen tyrosin-proteinkinas SRC som helt aktiverar c-RAF; den dubbla specificiteten mitogenaktiverat Kinas 1/2 (MEK1/2); de extracellulära signalreglerade kinaserna (ERK1/2).

integrering av PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR och RAS-MAPK pathways

PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR och RAS-MAPK pathways innehåller flera överlappande delar, som i originaldokumenten ofta modellerades på olika sätt baserat på något olika antaganden. Vi jämförde de överlappande reaktionerna mellan olika modeller och implementerade den mest aktuella versionen av dem baserat på den nuvarande kunskapen om cellulär biokemi. Dessutom krävde integrationen av de tre modellerna att hantera de olika måttenheter som antogs för att beskriva tillståndsvariablerna. Medan immunoblot-experiment tillåter att få viktig information om tidsplanen för signalhändelser, kvantitativ information om proteinuttryck är ofta problematisk att hämta så att de förutsagda koncentrationsprofilerna ibland rapporteras i mikromolär koncentration, som i Borisov et al. , eller i godtyckliga enheter (AU), som i Sonntag et al. . I kontrast, i Sedaghat et al. koncentrationen uttrycktes antingen i molära enheter eller i procent av den totala koncentrationen (t.ex. GLUT4-cytosolkoncentrationen ansågs vara 96% av den totala GLUT4-koncentrationen i cellen vid baslinjen).

potentiellt tillåter RBM att utföra både deterministiska och stokastiska simuleringar, förutsatt att variablmängder uttrycks i kopior av molekyler per cell. Även om vi i det nuvarande arbetet inte använde stokastisk simulering, anpassade vi alla variablerna till samma enhet, dvs. antal molekyler per celler, genom att multiplicera de molära enheterna med NA * V (NA indikerar Avogadro-nummer och V cellvolymen, anses vara lika med 3e-12 l). Alla detaljer om enhetskonvertering från AU och procentuella koncentrationer ges i Material och metoder.

den resulterande modellen består av 42 reaktionsregler och 101 parametrar som kodar för interaktionerna mellan 61 distinkta kemiska arter. Reaktioner, parametervärden och initiala förhållanden rapporteras alla i tilläggsfilen 1.

nyheter av RBM-ISP-modellen

RBM-implementeringen underlättade redovisning av ett antal ISP-funktioner, såsom fosforylering av signalproteiner på flera ställen och med flera effekter, samtidig interaktion mellan molekyler med olika bindningspartners och subcellulär lokalisering av vissa reaktioner. Ovanstående egenskaper diskuteras i detaljer i följande.

fosforylering av signalproteiner på flera ställen

signalmolekyler kan ha olika aktivitetsnivåer, beroende på vilka rester som fosforyleras. Tänk till exempel IRS1 och AKT. IRS1 har många rester som är potentiellt involverade i post-translationella modifieringar och kan aktiveras eller hämmas i sin kinasverkan, beroende på att den fosforylerade återstoden är Tyr eller Ser . Till exempel krävs Tyr-896-fosforylering för PI3K -, SHP2-och GRB2-bindning, medan ser-636-fosforylering med p70S6K är en mekanism relaterad till insulinresistens . AKT kan däremot aktiveras genom fosforylering vid Thr309 eller Ser474 av PDK1 respektive mTORC2 .

IRS1 fosforyleringsberoende aktivering / hämning inkluderades redan i Sedeghat-modellen även om man överväger ser-fosforylering reglerad av PKC och inte av p70S6K, som i Sonntag-modellen. Här modellerade vi både PKC-och p70S6K-åtgärder och beskrev pIRS1-Tyr896 komplex bildning/dissociation med PI3K , SHP2 och GRB2 .

de två fosforyleringsställena för AKT modellerades inte uttryckligen i Sedaghat et al. . Vi modellerade AKT-fosforyleringen vid Thr medierad av PI (3,4,5) P3 som i Sedaghat et al. modell och AKT-fosforylering vid Ser medierad av mTORC2 som i Sonntag et al. modell och antagen:

i)
AKT fosforylerat antingen vid Thr eller båda ställena för att verka på TSC1 / 2-komplex genom att förmedla dess fosforylering vid Tyr och defosforylering vid Ser ;
ii)
akt-fosforylering vid Ser eller båda ställena för att inaktivera C-RAF ;
iii)
AKT-fosforylering vid antingen Thr eller Ser för att aktivera GLUT4-translokation .

interaktion med flera bindningspartners

interaktionen mellan molekylerna i signalvägarna med många olika bindningspartners resulterar i potentiell bildning av olika komplex. I ISP, IRS1 fosforylerad vid Tyr – 896 kan binda PI3K som modellerad i Sedaghat et al. eller GRB2 / SOS och SHP2, som modelleras i Borisov et al. . För att matcha RBM-ISP-modellspecifikationen med den nuvarande kunskapen tillät vi bildandet av olika komplex. Således kan IRS1 binda på ett ömsesidigt exklusivt sätt GRB2 / SOS och SHP2, men kan binda samtidigt GRB2/SOS och P85 regulatorisk underenhet av PI3K .

Information om subcellulär lokalisering i reaktionsregler

möjligheten att proteiner måste interagera är ofta relaterad till deras fysiska lokalisering, dvs deras närvaro i det extracellulära utrymmet, cytoplasma, kärna, plasmamembran etc. Till exempel fungerar lipider PI (3,4,5) P3 som plasmamembrandockningsställen som rekryterar olika proteiner som innehåller pleckstrin-homologi (PH) domäner (t. ex. AKT och PDK1) och deras samlokalisering kan påskynda specifika signalhändelser . Ett annat exempel är interaktionen mellan mTORC1 och Ras-homologen berikad i hjärnan (RHEB) och Ragfamiljen på lysosommembran, rapporterad av Zoncu et al. . I vår modell inkluderade vi informationen om subcellulär lokalisering för insulinreceptorn och GLUT4-transportören, som skiljer mellan deras plasmatiska och cytoplasmatiska lokalisering enligt den matematiska beskrivningen som ges av Sedaghat et al. .

modellprognoser

koncentrationsprofilerna för alla kemiska arter som befolkade modellen simulerades vid 60 min, 100 nM insulinstimulering. 100 nM-koncentrationen representerar en väl accepterad nivå av insulinstimulering i cellkulturer som vanligtvis finns i litteraturen och används också av vår grupp . Enligt Sonntag et al. , antog vi också en konstant aminosyrastimulering, nödvändig för att erhålla mTORC1-aktiveringen och återkopplingen av p70S6K på IRS1. För att bedöma modellens tillförlitlighet jämfördes modellprognoser med experimentella data tillgängliga i vår dataset för vissa fosfoproteiner vid tiden 2, 5, 10, 30 och 60 min efter insulin plus aminosyror, dvs leucin, stimulering . Såsom visas i Fig. 2, de experimentella och förutsagda profilerna för pAKT-S473 och pmTORC1-S2448 är i god överensstämmelse, eftersom de båda visar ett ökande fosforyleringsmönster som når ett steady state under de första 2-5 min respektive 20-30 min. Den förutsagda profilen för ppERK1 / 2-Y202,y204 bekräftas av experimentella data under de första 10 minuterna, medan den i de sista tidpunkterna minskar snabbt i experimentella data med avseende på modellprognoser. Profilen som observerats i experimentella data för ppERK1/2-Y202,Y204, kan matchas närmare genom att öka styrkan i återkopplingen mellan ppERK1/2-Y202,Y204 och GRB2 / SOS. I Fig. 2 (övre högra panelen, streckad linje), den simulerade profilen för ppERK1/2-Y202,Y204 erhållen genom att multiplicera parametern kcat39 (se ytterligare fil 1) med en faktor 10 visas. Observera att i RBM ISP-modellen tillgänglig online bestämde vi oss för att lämna parametern för modellen oförändrad, dvs. vi använder värdet från litteraturen och skjuter upp parameteroptimering för framtida studier när ytterligare data kommer att finnas tillgängliga. Tyvärr var experimentella data för pP70S6K-T389 inte tillförlitliga (endast ett replikat tillgängligt), så vi kan inte jämföra de experimentella och simulerade profilerna för detta protein, vilket är en slutpunkt för vägen med en viktig återkopplingsåtgärd på IRS1. Icke desto mindre, den simulerade profil som visas i Fig. 2 (nedre, högra panelen) liknar experimentella data som visas i andra papper .

vi undersökte de förutsagda profilerna för alla aktiva arter och grupperade dem i fyra kluster enligt deras dynamiska beteende, som visas i Fig. 3:

snabbt svar, når steady state inom 2-5 min (blå)
snabb överskridande svar, når toppen inom 2-5 min och sedan steady state efter 10-20 min (grön)
långsamt svar, når steady state i 10-20 min (orange)
långsam överskridande svar, når toppen i 5-10 min och steady state i 30-60 min (lila).

efter insulinstimulering svarar insulinreceptorn snabbt genom fosforylering och utlöser en kaskad av händelser längs olika vägar. Längs PI3K – AKT-vägen kännetecknas alla mekanismer som är tätt relaterade till IRS1 Tyr-fosforylering av ett snabbt svar. Detsamma gäller för andra direkta mål för IRS1-fosforylerade vid Tyr längs TSC1/2-mTOR-kaskaden, dvs. AMPK-fosforylering vid bildandet av t172 -, SHP2-IRS1-och GRB2 / SOS-IRS1-komplex. Det snabba svaret kännetecknas av antingen en snabb ökning till steady state eller genom en övergående överskridning följt av steady state-tillståndet, beroende på frånvaron/närvaron av återkopplingsmekanismer som verkar på målmolekylen (fall 1 och 2, i blått respektive grönt, i Fig. 3). Mekanismer som mestadels utgör TSC1 / 2 – mTOR-vägen och spelar en roll i ser-fosforylering av IRS1 kännetecknas av ett relativt långsamt icke-överskridande svar (fall 3, orange i Fig. 3). Som observerats ovan antar RAS-MAPK-vägen i sina uppströmskomponenter ett snabbt svar, vilket blir märkbart långsammare för de nedströms (Fall 4, lila i Fig. 3).

i allmänhet kännetecknas molekyler nedströms vägen, relaterade till relativt långsamma processer såsom transkriptionsaktivering eller interaktion med miljön utanför cellen, såsom ERK1/2 och GLUT4, av långsamt svar medan molekyler uppströms vägen kännetecknas av ett snabbt svar för att framkalla en snabb signalutbredning. I detta sammanhang kan överskridningssvaret följt av återgången till ett stabilt tillstånd bidra till att uppnå en snabb signalutbredning på en signalväg, vilket gör molekyler igen tillgängliga för andra signalvägar omedelbart efter.

modellprognoser i frånvaro av kontrollmekanismer

ett antal simuleringar utfördes sedan för att undersöka systemets robusthet på två måleffekter av ISP: GLUT4 translokation och erk1/2 fosforylering. I synnerhet analyserades rollen för två stora kontrollmekanismer för att reglera måleffekterna:

p70s6k-IRS1 negativ återkopplingsslinga (röd linje i Fig. 1);
erk1/2-GRB2 / SOS negativ återkopplingsslinga (blå linje i Fig. 1);

för detta ändamål jämfördes tidsförloppet för GLUT4 och ERK1/2-Svar i närvaro och frånvaro av de två regleringsmekanismerna som anges ovan (Fig. 4). Dynamiken hos dubbelt fosforylerad ERK1/2 påverkas starkt av både p70s6k-IRS1 och erk1/2-GRB2 / SOS negativa återkopplingsslingor. Å andra sidan påverkas inte det stabila tillståndet och det dynamiska beteendet hos GLUT4 i membranet av ERK1/2, men påverkas starkt av p70s6k-IRS1 negativ återkopplingsslinga, vilket bekräftar den anmärkningsvärda betydelsen av denna senare kontrollmekanism vid bestämning av systemdynamiken.

det är välkänt att insulinresistens är förknippat med defekter i IRS-beroende signalering, vilket medför dess dysregulering vid initiering och progression av metabolisk sjukdom. En framväxande uppfattning är att den positiva/negativa regleringen av IRS genom autologa vägar undergrävs i sjukdom genom ökade basala och andra temporärt olämpliga serin/treonin fosforyleringar , vilket leder till minskat glukosupptag. Kompensatorisk hyperinsulinemi kan stiga vid denna tidpunkt och leda i slutändan till diabetes. Även om IRS1 (och IRS2) regleras genom en komplex mekanism som involverar fosforylering av mer än 50 olika serin/treoninrester, verkar i vår modell p70s6k-IRS1 negativ återkopplingsslinga nödvändig för en god kontroll av glukosupptag. Förbättring av p70s6k-IRS1 negativ återkopplingsslinga kan förklara en minskad insulinkänslighet och glukosupptag (Fig. 5). På samma sätt (även om de också antar en positiv feedback från mTOR till en annan IRS1-Serinrest), Br Auctorinnmark et al. , med en minimal modell av insulinsignalering, visa att en minskad positiv återkopplingsmekanism kan förklara ett minskat glukosupptag.

å andra sidan verkar både p70s6k-IRS1 och erk1/2-GRB2/SOS negativa återkopplingsslingor väsentliga för att garantera att dubbelt fosforylerad ERK visar ett övergående beteende, med en topp vid 10 min följt av en återgång till utgångsläge. Detta beteende har redan rapporterats i litteraturen under insulinstimulans och under epidermal tillväxtfaktorstimulans . Ett övergående erk-svar förhindrar en varaktig aktivering av ERK som skulle resultera i kontinuerlig cellproliferation .

känslighetsanalys

för att ytterligare undersöka rollen för de två stora kontrollmekanismerna vid reglering av måleffekterna utfördes lokal känslighetsanalys genom att applicera en liten störning (0.1% av parametervärdet) till en modellparameter i taget och utvärdera de resulterande relativa förändringarna av GLUT4-translokation och erk1 / 2-fosforylering (se metoder). Tabellerna 1 och 2 visar känslighetskoefficienterna för modellparametrarna, rankade i enlighet med deras absoluta värde och jämfört med värdet som koefficienterna antar vid avlägsnande av p70s6k-IRS1 och erk1/2-GRB2/SOS negativa återkopplingsslingor. Dessa koefficienter mäter den totala effekten, dvs under observationsfönstret, av en parameterändring på resultatet, dvs GLUT4 och ERK-svar. Positiva / negativa värden innebär att ökning av parametervärdet har effekten att förbättra/minska svaret. Eftersom små absoluta värden innebär att parameterförändringarna inte signifikant påverkar resultatet, rapporteras i tabellerna 1 och 2 endast koefficient större än 0,1 % (absolut värde), antingen i den ursprungliga eller modifierade modellen.

Tabell 1 parametrisk känslighetsanalys av den kompletta modellen för GLUT4 membrantranslokation

Tabell 2 parametrisk känslighetsanalys av den kompletta modellen för erk1 / 2-aktivering

parametrisk känslighetsanalys av den kompletta modellen för GLUT4-svar avslöjar att de mest känsliga parametrarna är relaterade till GLUT4-translokation till plasmamembran, följt av de som är relaterade till lipidbildning och IRS1_PI3K-komplex bildning/dissociation. Frånvaron av p70s6k_irs1-återkoppling har en stark inverkan på att öka känsligheten (absolutvärdet) för parametrar relaterade till lipidbildning och IRS1_PI3K-komplex bildning/dissociation.

parametrar relaterade till baslinje IRS1 fosforylering/defosforylering vid Tyr/Ser, har lägre känslighet, vilket minskar (absolut värde) i allmänhet genom att ta bort p70s6k-IRS1-återkoppling, med undantag för parameter k7p, relaterad till IRS1 fosforylering vid Ser. Parametrar relaterade till PKC-medierad IRS1-fosforylering vid Ser visar också ökade värden efter avlägsnande av p70s6k-IRS1-återkoppling. Eftersom erk1/2-GRB2 / SOS återkopplingsavlägsnande inte har någon effekt på GLUT4-translokation ändras inte känslighetskoefficienterna med och utan denna återkoppling.

parametrisk känslighetsanalys av den kompletta modellen för erk1/2-svar visar att de mest känsliga parametrarna är relaterade till RAS -, MEK-och RAF-aktivering och till IRS1-fosforylering vid Tyr och Ser, den senare medierad av p70S6K.längs både PI3K-AKT och RAS-ERK1/2-vägen verkar erk1/2-GRB2 / SOS-feedback ha en viktig roll för systemets robusthet. Systemdynamiken påverkas svagt av dess frånvaro (se Fig. 4), medan parameterkänsligheten ökar (i absolut värde) i nästan alla fall om denna feedback tas bort.

slutsatser om effekten av p70s6k-IRS1 feedback på erk1/2-Svar är mer kontroversiella. Att ta bort denna feedback har effekten att minska parameterkänsligheten längs PI3K_AKT-vägen, medan den längs RAS-ERK1 / 2-vägen nästan inte har någon effekt för parametrar relaterade till MEK-fosforylering, RAF-inaktivering och erk-fosforylering. Det minskar känsligheten för parametrar relaterade till RAS, RAF aktivering och IRS1-GRB2/SOS och IRS1-SHP2 komplexa störningar. Det förstärker starkt känsligheten hos parametrar relaterade till src-och RAF-aktivering.

dessa resultat belyser den centrala rollen av negativa återkopplingsslingor för att bestämma inte bara dynamiken i ett biologiskt system utan också dess robusthet. Denna egenskap är av anmärkningsvärd betydelse eftersom den bevarar systemets dynamiska beteende mot buller och små biologiska fluktuationer som vanligtvis beror på intercellulär variation.

en regelbaserad modell av insulinsignalväg