kodon användning och organisation av cellens cytoplasma
eftersom den genetiska koden är överflödig, kodande sekvenser uppvisar mycket varierande mönster av kodon användning. Om det inte fanns någon förspänning, bör alla kodoner för en given aminosyra användas mer eller mindre lika. Generna av B. subtilis har delats upp i tre klasser på grundval av deras kodonanvändningsförspänning. En klass består av huvuddelen av proteinerna, en annan består av gener som uttrycks på en hög nivå under exponentiell tillväxt, och en tredje klass, med A+T-rika kodoner, motsvarar delar av genomet som har bytts horisontellt. Vad är källan till sådana fördomar? Slumpmässiga mutationer skulle förväntas ha utjämnat eventuella skillnader, men så är inte fallet. Det finns också systematiska effekter av sammanhang, med vissa DNA-sekvenser som gynnas eller väljs mot.
cytoplasman i en cell är inte ett litet provrör. En av de mest förbryllande egenskaperna hos cytoplasmens organisation är att den rymmer närvaron av en mycket lång trådliknande molekyl, DNA, som transkriberas för att generera en mängd RNA-trådar som vanligtvis är så långa som hela cellens längd. Om mRNA-molekyler lämnades fria i cytoplasman skulle alla typer av knutna strukturer uppstå. Det måste därför finnas några organisatoriska principer som förhindrar att mRNA-molekyler och DNA blir intrasslade. Flera modeller, som stöds av experiment, postulerar ett arrangemang där transkriberade regioner är närvarande vid ytan av en kromoid, på ett sådant sätt att RNA-polymeras inte behöver omskriva den dubbla spiralen under transkription. Compartmentalization är viktigt även för små molekyler, trots att de kan diffundera snabbt. I en B. subtilis-cell som växer exponentiellt i rikt medium upptar ribosomerna mer än 15% av cellens volym. Cytoplasman är därför en ribosomgitter, i vilken de lokala diffusionshastigheterna för små molekyler, såväl som makromolekyler, är relativt långsamma. Längs samma linjer är den beräknade proteinkoncentrationen av cellen ca. 100-200 mg ml-1, en mycket hög koncentration.
translationsmaskinen kräver en lämplig pool av förlängningsfaktorer, aminoacyl-tRNA-syntetaser och tRNA. Att räkna antalet tRNA-molekyler intill en given ribosom konceptualiserar ett litet, ändligt antal molekyler. Som en konsekvens är en översättningsribosom en attraktor som verkar på en begränsad pool av tRNA-molekyler. Denna situation ger en form av selektivt tryck, vars resultat skulle vara anpassning av kodonanvändningsförspänningen för det översatta meddelandet som en funktion av dess position i cytoplasman. Om kodonanvändningsförspänning skulle förändras från mRNA till mRNA, skulle dessa olika molekyler inte se samma ribosomer under livscykeln. I synnerhet, om två gener hade mycket olika kodonanvändningsmönster, skulle detta förutsäga att motsvarande mRNA inte bildas inom samma sektor av cytoplasman.
när mRNA-trådar kommer ut från DNA blir de förlovade av ribosomernas gitter, och de spärrar från en ribosom till nästa, som en tråd i en tråddragningsmaskin (Observera att detta är exakt motsatt syn på översättning som presenteras i läroböcker, där ribosomer ska färdas längs fasta mRNA-molekyler). I denna process syntetiseras framväxande proteiner på varje ribosom och sprids genom cytoplasman genom linjär diffusion av mRNA-molekylen från en ribosom till nästa. Men när mRNA lossnar från DNA måste transkriptionskomplexet ibland bryta upp. Bruten mRNA är sannolikt en farlig molekyl eftersom den, om den översätts, skulle producera ett stympat protein. Sådana proteinfragment är ofta giftiga, eftersom de kan störa arkitekturen hos multisubenhetskomplex (detta förklarar varför många nonsensmutanter är negativa dominerande, snarare än recessiva). Det finns en process som hanterar denna typ av olycka i B. subtilis. När en för tidigt avslutad mRNA-molekyl når sin ände, slutar ribosomen att översätta, dissocierar inte och väntar. Ett specialiserat RNA, tmRNA, som viks och bearbetas vid sin 3′-ände som en tRNA och laddas med alanin, kommer in, sätter in sin alanin vid C-änden av den framväxande polypeptiden och ersätter sedan mRNA i en ribosom, där den översätts som ASFNQNVALAA. Denna svans är en proteinmärke som sedan används för att rikta den till ett proteolytiskt komplex (ClpA, ClpX), där det bryts ned.
organisationen av ribosomgitteret, kopplat till organisationen av kromoidens transkriberande yta, säkerställer att mRNA-molekyler översätts parallellt med varandra, på ett sådant sätt att de inte gör knutar. Polycistroniska operoner säkerställer att proteiner med relaterade funktioner samuttrycks lokalt, vilket möjliggör kanalisering av motsvarande mellanprodukter. På detta sätt kopplas strukturen hos mRNA-molekyler till deras öde i cellen och till deras funktion i avdelning. Gener som översätts sekventiellt i operoner är fysiologiskt och strukturellt kopplade. Detta gäller också för mRNA som översätts parallellt med varandra, vilket tyder på att flera RNA-polymeraser är engagerade i transkriptionsprocessen samtidigt, ok som dragdjur. Om det finns korrelation mellan funktion och/eller lokalisering i en dimension, finns det faktiskt en liknande begränsning i ortogonala riktningar. Eftersom ribosomer lockar tRNA-molekyler, åstadkommer de en lokal koppling mellan dessa molekyler och kodonerna som översätts. Detta förutspår att en given ribosom företrädesvis skulle översätta mRNA med liknande mönster av kodonanvändning. Som en konsekvens, när man rör sig bort från en starkt förspänd ribosom, skulle det finnas mindre och mindre tillgänglighet av de mest förspända tRNA. Detta skapar ett urvalstryck för en gradient av kodonanvändning, eftersom man går bort från de mest förspända meddelandena och ribosomerna, häckande transkript runt centrala kärnor, bildade av transkript för mycket förspända gener. Slutligen skapar ribosomsyntes en repulsiv kraft som skjuter DNA-strängar bort från varandra, särskilt från regioner nära replikationens ursprung. Tillsammans resulterar dessa processer i en gengradient längs kromosomen, vilket är ett viktigt element i cellens arkitektur.