C Metyleringsmedel
korskänsligheten hos vissa bakteriestammar mot UV-bestrålning och det monofunktionella alkyleringsmedlet MMS, i motsats till de hittills diskuterade föreningarna, verkar inte bero på ett liknande erkännande av exciserbar skada av samma endonukleas som känner igen tymindimerer i DNA. Förekomsten av bakteriella mutanter som är känsliga för MMS är prima facie-bevis för förekomsten av reparationsmekanismer i vildtypen, men det verkar nu som om det inte är en alkylerad bas i sig som känns igen av en reparationsmekanism utan förmodligen en enda strängbrytning i DNA. Efter MMS-behandling inaktiverades B. subtilis genom bildandet av enkelsträngsbrott i DNA, vilket det visades, vildtyp B. subtilis kan reparera (Strauss och Wahl, 1964; Prakash och Strauss, 1970); emellertid var en MMS-känslig mutant bristfällig eller saknad i denna kapacitet. Dessutom hävdades det att den observerade korskänsligheten mot UV-eller röntgenstrålar kunde förklaras av bildandet av enkelsträngsbrott som är kända för att bildas av dessa senare medel.
bekräftelse av denna synvinkel erhölls från egenskaperna hos en B. subtilis mutant som var känslig för UV-bestrålning men inte för MMS (Searashi och Strauss, 1965). Den metyleringen av DNA-baser, snarare än MMS-inducerade strängbrott, framkallar inte någon excisionsreparation I B. subtilis visades också tydligt av misslyckandet att observera någon signifikant förlust av metylgrupper från DNA av vildtyp eller känsliga celler under flera cellgenerationer. Detta resultat indikerade cellernas kapacitet att replikera metylerat DNA och överensstämmer med den replikativa kapaciteten hos DNA modifierat genom arylalkylering (Venitt och Tarmy, 1972).
ovanstående studie om reparation av MMS-inducerad metyleringsskada I B. subtilis kan därför kontrasteras med andra studier om reparation av alkyleringsskador som införts av det monofunktionella metyleringsmedlet MNNG (Lawley och Orr, 1970) i E. coli B/r. det skiljer sig från MMS genom att producera en märkbart högre andel O 6-metylguaninrester i alkylerat DNA. Denna produkt såväl som 3-metyladenin och eventuellt vissa oidentifierade produkter (ursprungsmaterial på papperskromatogram) verkar selektivt skäras ut jämfört med förlust av N −7-metylguanin från DNA från E. coli B/r-celler under betingelser som tillåter både tillväxt och DNA-syntes. 3-Metyladenin och O 6-metylguanin men inte ursprungsmaterialet skars också ut från Bs–1-celler men möjligen med reducerad hastighet. Det angavs inte av Lawley och Orr huruvida det fanns någon skillnad i överlevnad av mnng-behandlade b/r–och Bs-1-celler som kan indikera att sådana skillnader i excisionskapacitet återspeglar driften av en DNA-reparationsmekanism som hjälper cellöverlevnad. Dock, Kondo et al. (1970) rapporterade ingen ökad dödlighet eller ökad mutationsfrekvens i E. coli, för stammar som inte kan ta ut pyrimidindimerer, efter behandling med MNNG, jämfört med MMS. Detta trots att alkylering av DNA med MNNG producerar 20 gånger mängden O 6-metylguanin än som produceras genom alkylering av DNA med MMS (Lawley et al., 1971–1972).
bevis för att denna ”förlust” av 3-metyladenin och O 6-metylguanin medieras av en enzymisk excisionsmekanism, som skiljer sig från ett UV-endonukleas, har kommit från in vitro-studier om egenskaperna hos ett enzym, betecknat endonukleas II, isolerat från E. coli (Friedberg och Goldthwait, 1969). Detta enzym kan bryta fosfodiesterbindningar i DNA som har reagerats med alkyleringsmedlet MMS och att känna igen depurinerade ställen i DNA. På senare tid har det visat sig frigöra O 6-metylguanin och N 3-metyladenin men inte N 7-metylguanin från DNA som hade metylerats av cancerframkallande MNU (Kirtikar och Goldthwait, 1974). Endonukleas II har därför tydligt många olika funktioner, varav en verkar kunna bryta glykosidbindningar kopplade till vissa substituerade puriner. Å andra sidan kan det möjligen vara en blandning av enzymer. Förekomsten av ett enzym som på liknande sätt kan utföra denna postulerade klyvning av N-glykosidbindningar (och därför kallas ett N-glykosidas) har nyligen isolerats från E. coli och visat sig frigöra fri uracil från DNA-innehållande deaminerade cytosinrester (Lindahl, 1974). Det resulterande depurinerade stället kan sedan kännas igen och repareras av ett annat associerat enzymsystem (jfr. Verly och Paquette, 1972). Specificitet av en E. coli-beredning har också observerats för 3-alkyladenin men inte för 7-alkyladenin av Papirmeister et al. (1970). 3-Etyladenin och O 6 −etylguanin men inte n-7-etylguaninrester i DNA som bildas genom reaktion av N-etyl-n-nitrosourea har visat sig vara på liknande sätt utskurna från E. coli WP2-DNA (Lawley och Warren, 1975). Excision av de mindre produkterna av purinalkylering har nu observerats i däggdjursceller in vivo, och dessutom har minskad excisionskapacitet i vissa vävnader korrelerats med målorganets identitet för vissa alkylerande cancerframkallande ämnen (se senare avsnitt i, C i del B).
den uppenbara bristen på erkännande och excision av N 7-alkylguaninrester i DNA genom en reparationsmekanism, vilket indikeras av studierna av Prakash och Strauss (1970) och av Lawley och Orr (1970), var också tydligt i studier av Kimball et al. (1971a) om effekterna av MMS och MNNG i Haemophilus influenzae. Det är därför något förvånande att samma Rest verkar erkännas i Euglena gracilis. Efter metylering med N-metyl-N-nitroso-p-toluensulfonat förlorades 7-metylguanin från DNA med en halveringstid på 10 timmar (Olson och McCalla, 1969) vilket är märkbart kortare än halveringstiden på cirka 5 dagar för spontan hydrolys vid pH 7,4 i citronsyra-fosfatbuffert (Margison et al., 1973). Dessutom utskärde en resistent mutantstam uppenbarligen N-7-metylguaninen snabbare än den känsliga stammen med utseendet av mononukleotider från nedbrutet DNA i cellens supernatant (Olson och McCalla, 1969). Detta oväntade resultat förtjänar därför ytterligare utredning. Dessa fynd, sedan, tillsammans med den lilla indikationen på en snabbare förlust av 7-metylguanin från råttlever-DNA in vivo noterat av Margison et al. (1973), men inte av Craddock (1973a), kan föreslå att denna DNA-substituent kan erkännas av ett reparationsenzym under vissa omständigheter.
tabell VI sammanfattar ovanstående exempel på förlust av kemiska produkter från bakteriellt DNA.