kliniska procedurer
både VHX–och BPD-försöken genomfördes av Shoklo Malaria Research Unit i kliniker längs gränsen mellan Thailand och Myanmar i nordvästra Thailand, ett område med låg säsongsbunden malariatransmission18,19. Patientpopulationerna inkluderar migrerande arbetstagare och fördrivna personer från Burman och Karen etnicitet38. Under tiden dessa studier genomfördes var primaquine radical cure-behandling inte rutinmässig.
i båda studierna detekterades återkommande episoder aktivt vid schemalagda besök med mikroskopi (nedre detektionsgränsen är cirka 50 parasiter per \(\upmu{\mathrm{{L}}}\)). Patienter uppmuntrades att komma till klinikerna mellan schemalagda besök när de var sjuka och så upptäcktes vissa återfall passivt (mindre än 5%). Alla återfall behandlades, oavsett symtom.
etiskt godkännande
BPD-studien godkändes av både Mahidol University Faculty of Tropical Medicine Ethics Committee (MUTM 2011-043, TMEC 11-008) och Oxford Tropical Research Ethics Committee (OXTREC 17-11) och registrerades på ClinicalTrials.gov (NCT01640574). VHX-studien fick etiskt godkännande av Mahidol University Faculty of Tropical Medicine Ethics Committee (MUTM 2010-006) och Oxford Tropical Research Ethics Committee (OXTREC 04-10) och registrerades vid ClinicalTrials.gov (NCT01074905).
vivax History trial (VHX)
denna randomiserade kontrollerade studie genomfördes mellan maj 2010 och oktober 2012. Totalt randomiserades 644 patienter äldre än 6 månader och som vägde mer än 7 kg med mikroskopi bekräftad okomplicerad P. vivax mono-Art infektion (endast P. vivax) för att få artesunat (2 mg/kg per dag i 5 dagar), klorokin (25 mg Bas per kg fördelat på 3 dagar: 10, 10 och 5 mg/kg) eller klorokin plus primakin (0, 5 mg Bas per kg per dag i 14 dagar).
patienter med G6PD-brist (som bestäms av fluorescerande spottest) randomiserades endast till artesunat-och klorokinmonoterapigrupperna. Ämnen följdes dagligen för övervakad läkemedelsbehandling. Uppföljningen fortsatte varje vecka i 8 veckor och sedan var 4: e vecka i totalt 1 år. Patienter med mikroskopi bekräftade P. vivax-infektioner retreated med samma studieläkemedel som i den ursprungliga tilldelningen. Patienter i artesunat-eller klorokinmonoterapigrupperna som upplevde mer än 9 återfall fick radikal botande behandling med standardprimakinregimen (0, 5 mg Bas per kg per dag i 14 dagar).
Best Primaquine Dose trial (BPD)
mellan februari 2012 och juli 2014 registrerades 680 patienter äldre än 6 månader i en fyrvägs randomiserad kontrollerad studie som samtidigt jämförde två regimer av primaquin (0,5 mg / kg per dag i 14 dagar eller 1 mg/kg per dag i 7 dagar) kombinerat med en av två blodstegsbehandlingar: klorokin (25 mg Bas per kg) eller dihydroartemisinin-piperakin (dihydroartemisinin 7 och piperakin 55 mg/kg). Alla doser övervakades.
inkluderings-och uteslutningskriterierna för denna studie var desamma som för VHX-studien, förutom följande: patienter uteslöts om de var G6PD-bristfälliga av fluorescerande fläcktest, hade en hematokrit mindre än 25% eller hade fått blodtransfusion inom 3 månader.
uppföljningsbesök inträffade vecka 2 och 4 och därefter var 4: e vecka under totalt ett år. Alla återkommande P. vivax-infektioner detekterade genom mikroskopi (samma kriterier som för VHX) behandlades med en standardbehandling av klorokin (25 mg Bas per kg under 3 dagar) och primakin (0, 5 mg Bas per kg per dag i 14 dagar).
Mikrosatellitgenotypning
helblod för fullständigt blodtal samlades in genom venipunktur i ett 2 mL EDTA-rör. Det återstående helblodet frystes vid -80 kcal C. P. vivax genomiskt DNA extraherades från 1 mL venöst blod med hjälp av ett automatiserat DNA-extraktionssystem QIAsymphony SP (Qiagen, Tyskland) och QIAsymphony DSP DNA mini kit (Qiagen, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. För att jämföra de genotypiska mönstren för primära infektioner och återfall, genotypade vi initialt med tre polymorfa mikrosatellitlokaler som gav mycket ren förstärkning: inga stamtoppar och tillförlitlighet av PCR-amplifiering vid de låga parasitdensiteterna som vanligtvis finns i återkommande infektioner. Dessa kärnlokaler var PV.3.27, PV.3.502, och PV. ms8. En seminested PCR tillvägagångssätt antogs för alla fragments12, 39. Alla amplifieringsreaktioner utfördes i en total volym av 10 oktl och i närvaro av 10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/L KCl, 250 nmol/L av varje oligonukleotidprimer, 2,5 mmol/L MgCl2, 125 oktmol/l av var och en av de fyra deoxynukleosidtrifosfaterna och 0,4 U TaKaRa-polymeras (TaKaRa BIO). Primära amplifieringsreaktioner initierades med 2 sekl av mallgenomiskt DNA framställt från blodproverna och 1 sekl av produkten av dessa reaktioner användes för att initiera de sekundära amplifieringsreaktionerna. Cykelparametrarna för PCR var följande: initial denaturering för 5 min vid 95 CCG C föregick glödgning utförd för 30 s vid 52 CCG C, förlängning utförd för 30 s vid 72 CCG och denaturering utförd för 30 s vid 94 CCG C. Efter ett slutligt glödgningssteg utfördes, följt av 2 min förlängning, stoppades reaktionen. PCR-produkter lagrades vid 4 msk C tills analys.
genotyperna av parasiter i återkommande prover jämfördes med de i inskrivningsprover, och provpar tilldelades en rå klassificering baserad på IBS, definierad som relaterad baserat på majoritets IBS, om två eller tre av tre loci-typade visade bevis på IBS, och olika baserat på majoritet inte IBS, annars. Heteroalleliska samtal hade bevis på IBS om de inkluderade ett samtal som var identiskt med ett annat över jämförelsen. Om de parade proverna klassificerades som relaterade baserat på majoriteten IBS, eller om en eller flera av de initiala loci misslyckades med att förstärka, sex ytterligare (icke-kärna) mikrosatellitmarkörer genotypades (PV.1.501, PV. ms1, PV.ms5, PV.ms6, PV.ms7 och PV. ms16). för varje mikrosatellit finns detaljer inklusive motiv, kromosom och position i kompletterande tabell 3. Antal episoder partitionerade med antalet ytterligare markörer som skrivits framgångsrikt finns i Tilläggstabell 4. För att se om ytterligare markörer bias återfall inferens, partitionerade vi sannolikheten för återfall som härleddes i null genetiska data med antalet markörer som används för att uppskatta sannolikheten för återfall. Ytterligare markörer förspänner inte återfallsinferensens: sannolikheten för återfall minskar från föregående med en till tre markörer och stabiliseras därefter cirka 0,25 (kompletterande Fig. 5).
för allel som anropar mikrosatelliterna mättes längden på PCR-produkterna i jämförelse med interna storleksstandarder (Genescan 500 LIZ) på en ABI 3100 genetisk analysator (Pe Applied Biosystems), med användning av GENESCAN och GENOTYPPROGRAMVARA (Applied Biosystems) för att mäta allellängder och för att kvantifiera topphöjder. Flera alleler kallades när det fanns flera toppar per locus och där mindre toppar var \(> 33 \%\) av höjden på den dominerande allelen. Vi inkluderade negativa kontrollprover (humant DNA eller ingen mall) i varje amplifieringskörning. En delmängd av proverna (n = 10) analyserades i tre exemplar för att bekräfta konsistensen av de erhållna resultaten. Alla par av primers testades för specificitet med hjälp av genomiskt DNA från P. falciparum eller människor.
tid-till-händelse-modell av vivax malaria återfall
för återkommande P. vivax-infektioner i VHX-och BPD-studierna utvecklade och jämförde vi två Bayesianska blandade effekter blandningsmodeller som beskriver tid-till-händelse-data som är villkorade av det administrerade behandlingsläkemedlet. Den första modellen (modell 1) antog 100% effekt av högdos primakin med endast reinfektion möjlig efter radikal botemedel. Den andra modellen (modell 2) möjliggjorde återfall och rekrudescens efter högdos primakin. En fullständig förteckning över antaganden för båda modellerna finns i Tilläggstabell 5. Modell 1 fungerade som en basmodell för att bedöma robusthet. Modell 2 användes som den slutliga modellen och alla rapporterade uppskattningar härrör från den. Notation valdes för att överensstämma med den matematiska notationen för den genetiska modellen (se nedan). Observera att i modellnotationen som följer \(n\) är ett index, medan det ovan används för att beteckna räkningar. För varje individ indexeras av subscript \(n\i 1..N\), registrerar vi tidsintervallen (i dagar) mellan successiva P. vivax-avsnitt (inskrivningsavsnittet betecknas avsnitt 0). Det sista tidsintervallet är rätt censurerat i slutet av uppföljningen. Modellerna antar ingen urvalsförskjutning från förlust till uppföljning. För individen \({n}{{\mathrm{{th}}}}\) är data om tidsintervallet \(t\) (tiden mellan episod \(t-1\) och episod \(t\)) av formen \({{\boldsymbol{x}}}_{n}^{(t)}\) = {\({d}_{n}^{t}, {Z}_{n}^{t}, {C}_{n}^{t}, {S}_{n}\)}, där \({d}_{n}^{t}\in \{{\rm{as}}, {\rm{CQ}}, {\rm{PMQ}}+\}\) är läkemedelskombinationen som används för att behandla episod \(t-1\) (som: artesunate monoterapi; CQ: klorokin monoterapi; PMQ\({}^{+}\): primaquine plus blood-stage treatment), \({Z}_{n}^{t}\) är tidsintervallet i dagar, \({C}_{n}^{t}\in \{0,1\}\) anger om intervallet censurerades där 1 motsvarar en höger censurerad observation (dvs. uppföljningen avslutades innan nästa återfall observerades) och 0 motsvarar en observerad återkommande infektion, och \({s}_{n}\) betecknar studien i vilken patienten rekryterades (1: VHX, 2: BPD). I allmänhet, låt \({{\boldsymbol{x}}} _ {n}\) = {\({{\boldsymbol{x}}}_{n}^{(0)},\ldots ,{{\boldsymbol{x}}} _ {n}^{(T)}\)} anger all tillgänglig tid-till-händelse-data för individen \({n}{{\mathrm{{TH}}}}\). Få återfall (åtta) inträffade under de första 8 veckorna för patienter randomiserade till dihydroartemisinin-piperakinarmarna i BPD-studien, så vi modellerade den postprofylaktiska perioden av piperakin som identisk med klorokin (dvs. PMQ\({}^{+}\) inkluderar både klorokin och dihydroartemisinin-piperakin som blodstegsbehandlingar). I verkligheten är eliminationsprofilerna och inneboende aktiviteter något annorlunda, med piperakin som ger något längre asexuell scenundertryckning än klorokin.
i båda modellerna modelleras tid till återfall som en blandning av fyra fördelningar, med blandningsvikter beroende på behandlingen av föregående avsnitt. Blandningsfördelningarna motsvarar de olika återfallstillstånden. De fyra blandningarna är: reinfektion, ges av en exponentiell fördelning; tidigt (periodiskt) återfall, ges av en Weibullfördelning med behandlingsdrogberoende parametrar; sen (konstant hastighet) återfall, ges av en exponentiell fördelning; rekrudescens, ges av en exponentiell fördelning. Modell 2 anger olika blandningsproportioner för återinfektionskomponenten i icke-primakin-och primakingrupperna, \({p}_{n}^{{\rm{AS}}}={p}_{n}^{{\rm{CQ}}}\) respektive \({p}_{n}^{{\rm{PMQ+}}}\). Blandningsproportionen mellan tidig / periodisk och sen/konstant återfall inom återfallskomponenten är densamma över primakin-och icke-primakingrupper.
sannolikheten för modell 2 anges som
där \({P}_{N}^{(\cdot )}\in (0,1)\) är den individuella och läkemedelsspecifika blandningen sannolikheten för återinfektion (vi ställer in före för att återspegla vår tro att \({p}_{n}^{{\rm{AS}}}={p}_{n}^{{\rm{CQ}}}\ < \ {p}_{n}^{{\rm{PMQ+}}}\)) och \({c}^{(\cdot )}\in (0,1)\) är kapslade läkemedelsspecifik blandning sannolikheten för recrudescens.
sannolikheten för modell 1 är densamma förutom att \({p}_{n}^{{\rm{PMQ+}}}=1\) (endast återinfektion möjlig). \({\mathcal{e}} (\cdot )\) betecknar den exponentiella fördelningen. I båda modellerna är \({\lambda }_{{s}_{n}}\) den studiespecifika återinfektionshastigheten. Förhållandet mellan \({\lambda }_{1}\) och \({\lambda }_{2}\) parametriseras som \({\lambda }_{2}=\delta {\lambda }_{1}\) där priorer anges för \({\lambda }_{1}\) och \(\delta\). \(\delta\) specificerade minskningen av överföringen mellan VHX-och BPD-studieperioderna. \({\lambda } _{{\rm{RC}}}\) är rekrudescenshastigheten (antagen läkemedelsoberoende). \({c}^{{D}_{n}^{t}}\) är en läkemedelsberoende kapslad blandningsandel mellan rekrudescens och återfall. Tiden till återfall är i sig en blandningsfördelning där \(q\) är den dubbelt kapslade blandningsproportionen mellan tidiga (första komponenten) och sena (andra komponenten) återfall. Detta är en fast andel för alla individer. De sena / konstanta återfallen parametriseras av hastighetskonstanten \(\gamma\). De tidiga återfallen antas vara Weibull distribuerade, betecknade \({\mathcal{W}}(\cdot ,\cdot )\), med läkemedelsberoende skalparametrar \({\mu }_{{d}_{n}^{t}}\) och formparametrar \({k}_{{D}_{n}^{t}}\) varigenom med \({\mu }_{{\rm{CQ}}}={\mu }_{{\rm{PMQ+}}}\) och \({k}_{{\rm{CQ}}}={k}_{{\rm{PMQ+}}}\).
den individuella marginalsannolikheten för återinfektion ges av \({p}_{n}^{{D}_{n}^{t}}\); den individuella marginalsannolikheten för rekrudescens ges av \(\left{c}^{{D}_{n}^{t}}\); den individuella marginalsannolikheten för återfall ges av \(\left\left\).
vi använde informativa tidigare fördelningar (kompletterande Tabell 1) för att säkerställa identifierbarhet av blandningskomponenterna. Informationsinnehållet i data, utöver det som anges i prior, undersöktes visuellt med hjälp av tidigare till bakre tomter. Den tidigare till bakre tomten för modell 2 visas i kompletterande Fig. 6. Identifierbarhet av parametrar bestämdes genom simulering. Femtio syntetiska datamängder drogs från var och en av de datagenererande processer som definieras av modellerna 1 och 2 och en modifierad version av modell 2 som införlivade säsongsreinfektion. Säsongskomponenten uppskattades från den empiriska fördelningen av inskrivningsveckan i BPD-och VHX-studierna. Modellerna passade sedan till dessa simulerade datamängder och uppskattade parametrar jämfördes med simulerings-sanningsparametrar. Kompletterande Fig. 7 visar de uppskattade PMQ + – felfrekvenserna (med modell 2) jämfört med de verkliga felfrekvenserna för data som genereras under modell 2 (väl specificerad modellpassning) respektive för data som genereras under säsongsversionen av modell 2 (felspecificerad modellpassning). Säsongsbunden återinfektion resulterar i en liten överskattning av felfrekvensen. Bakre modellkontroll gjordes genom att simulera 500 syntetiska tid-till-händelse-dataset under den bakre prediktiva fördelningen av den slutliga modellpassningen. Antalet återfall per personår för varje behandlingsarm valdes som sammanfattande statistik som används för att beräkna bakre prediktiva p-värden (kompletterande Fig. 7).
stan-modellerna utmatar (i) Monte Carlo bakre fördelningar för alla modellparametrar; (ii) bakre uppskattningar av återfallstillstånd för varje tidsintervall \({{\boldsymbol{x}}}_{n}^{(t)}\); (iii) log sannolikhetsuppskattningar för varje bakre dragning. För varje modell körde vi åtta kedjor med \(1{0}^{5}\) iterationer, gallring per 400 iterationer och kassera hälften för inbränning. Konvergens av MCMC-kedjor bedömdes med hjälp av traceplots som bedömde blandning och överenskommelse mellan de åtta oberoende kedjorna. Alla dessa analyser kan replikeras med online github-förvaret.
allelfrekvenser och effektiv kardinalitet
för varje mikrosatellitgenotyp uppskattades allelfrekvenser med alla tillgängliga genetiska data från anmälningsepisoderna (137 VHX, 79 BPD) och en multinomial-Dirichlet-modell (kompletterande Fig. 8). För varje markör uppskattades den effektiva kardinaliteten \({n}^{* }\), definierad som antalet alleler som ger samma sannolikhet för identitet av en slump givet equifrequent allelfrekvenser, som en över summan av allelfrekvenserna squared40. Från de effektiva kardinaliteterna kan vi beräkna antalet hypotetiska bialleliska SNP: er som de nio mikrosatelliterna motsvarar enligt följande:
där \(m\) är indexet över\ (m = 9\) mikrosatelliter och logaritmen är base \({n}_{{\rm{SNP}}}^{* }\), den antagna genomsnittliga effektiva kardinaliteten hos en hypotetisk SNP. Detta är 2 för en idealisk SNP och ungefär 1,5 för en realistisk SNP40.
genetisk modell
den genetiska modellen matar ut sannolikheten för att en återkommande P. vivax episod i en given individ är en recrudescens, återfall, eller återinfektion med avseende på tidigare observerade episoder, ges tre ingångar: (1) tidigare sannolikheter att episoden är en recrudescens, återfall, eller återinfektion (i detta arbete de är baserade på tid-till-händelse-data); (2) en uppsättning av population-nivå allel frekvens uppskattningar; (3) tillgängliga genetiska data för de observerade episoderna för den givna individen var och en med högst nio polyallelic microsatellite markörer. För att sprida osäkerhet i (1) och (2) drar vi 100 Monte Carlo-prover från tid-till-händelse-modellen och från de bakre Dirichlet-fördelningarna över allelfrekvenser för varje markör. Den genetiska modellen fångar inte osäkerhet på grund av variation i antalet genotypade markörer eftersom det är beräkningsmässigt oöverkomligt att göra det för närvarande. Icke desto mindre tolkar den genetiska modellen inte begränsade data: när genotypade markörer är få returnerar den helt enkelt uppskattningar nära föregående. Resten av detta avsnitt ger en informell beskrivning av modellen. En detaljerad beskrivning med en lista över antaganden och den fullständiga matematiska specifikationen finns i Tilläggsmetoderna.
för en given individ anses parasiter inom och över infektioner antingen vara främlingar, syskon eller kloner i förhållande till varandra (främlingar hänvisar till alla parasiter vars delade anor går utöver en enda mygga). Uppsättningen av interparasitrelationer kan representeras av en helt ansluten graf. Varje vertex representerar en haploid genotyp, och varje kant mellan genotyper är märkt som ett syskon eller en främling när genotyperna finns inom samma infektion, eller som en klon, ett syskon eller en främling när genotyperna är från olika infektioner. För komplexa infektioner ställs antalet hörn lika med COI, vilket definieras som det maximala antalet alleler per observerad markör.
modellen antar att återfall kan uppstå för alla interparasitrelationer över infektioner (främlingar, syskon och kloner), medan återinfektioner endast uppträder som främlingar och endast som kloner. De viktigaste stegen i modellen är följande. Först beräknar vi sannolikheten för de genetiska data som ges en märkt relationsgraf. För det andra beräknar vi sannolikheten för den föreslagna grafen med tanke på att den återkommande episoden är en recrudescens, ett återfall och en reinfektion. För det tredje summerar vi över alla möjliga grafer. Uppsättningen av märkta grafer innehåller alla möjliga sätt att fasa mikrosatellitdata (dvs. attribut alleler till haploida genotyper i komplexa infektioner) samt alla livskraftiga relationer mellan haploida genotyper. Till exempel, om genotyp A är en klon av B och B är en klon av C, är det enda livskraftiga förhållandet mellan A och C klonal.
begreppet relatedness (Sannolikhet för IBD) funktioner i det första steget. Modellen uppskattar dock inte släktskap. Istället uppskattar den sannolikheten för att observera de data som ges IBD multiplicerat med sannolikheten för IBD villkorad av ett specificerat förhållande (t.ex. 0,5 för syskon i en outbred population). Denna beräkning använder allelfrekvenser (delade vanliga alleler kan vara identiska men inte nödvändigtvis på grund av nedstigning, medan delade sällsynta alleler är mer troliga IBD). Vi summerar sedan över de två möjliga IBD-scenarierna (alleler är IBD eller inte) för att få sannolikheten för de observerade data som är villkorade av det angivna förhållandet,
detta beräknas för alla parvisa relationer i relationsdiagrammet (se kompletterande metoder för fullständig information).
den genetiska modellens beräkningskomplexitet begränsar den till den gemensamma analysen av tre episoder (två återfall) per patient (i våra data är detta fallet för 158 patienter). För varje individ med mer än två återfall (54 patienter) uppskattade vi parvisa sannolikheter för återfallstillstånd mellan episoder (med hjälp av ovanstående modell) och konstruerade en angränsande matris. Återfallssannolikheter definierades sedan som proportionella mot den maximala uppskattade sannolikheten för återfall med avseende på alla föregående episoder och de av recrudescens med avseende på det direkt föregående avsnittet. Sannolikheten för återinfektion är komplementet till sannolikheten för återfall plus rekrudescens. Dessa sannolikheter vägdes sedan om för att summera till 1.
genetisk simulering
vi använde simulering för att utforska markörkrav för återkommande tillståndsavledning. Som beskrivits ovan simulerades data om 3 till 12 oberoende mikrosatellitmarkörer för parade infektioner (en primär episod följt av en enda återfall) under tre scenarier: återfallet innehåller en haploid parasitgenotyp som antingen är ett syskon, främling eller klon av en haploid parasitgenotyp i den primära infektionen. De simulerade data analyserades förutsatt att en enhetlig prior över återfallstillstånden (dvs. recrudescens, reinfektion och återfall var och en har tidigare sannolikheter på en tredjedel). För var och en av främlingen, syskon och klonala scenarier, vi simulerade data för en initial och återkommande infektion med respektive COIs 1 & 1, 2 & 1, och 1 & 2, med och utan fel; och respektive COIs 3 & 1, utan fel. För att illustrera modellens beteende när den applicerades på felaktiga data simulerades data med fel med en extremt hög per-locus Sannolikhet för fel (0,2 kontra realistiskt fel \(<\ 0.01\)41). När COIs överskred en, var syskon, främling eller klon bland orelaterade främmande haploida genotyper (en relationsgraf med högst en enda icke-främling kant). För en given uppsättning COIs ger denna typ av graf mycket olika data och är därmed den mest utmanande att analysera. För icke-felaktiga episoder med COIs i 1 eller 2 undersökte vi kardinaliteter på 13 och 4 (genomsnittet respektive minimum av vår panel med nio mikrosatelliter). För felaktiga data och för episoderna med COIs av 3 & 1 använde vi kardinalitet lika med 13 endast. Resultaten av en illustrativ delmängd av de genetiska simuleringarna presenteras i Fig. 5 och kompletterande fikon. 3 och 4. Alla genetiska simuleringar kan replikeras från nätet github förvaret, se mapp Simulation_Study.
klassificering av återkommande episoder
uppskattningen av den falska felupptäckningsgraden för den genetiska modellen och Fig. 4 båda kräver specifikation av klassificeringsgränser. Vi valde godtyckligt intervallet som osäkerhetszonen. Varje återfall klassificeras antingen som en reinfektion eller ett misslyckande där misslyckande är antingen ett återfall eller en recrudescens: om summan av de övre trovärdiga intervallen för återfall plus recrudescens är mindre än 0,3, klassificeras återfallet som en reinfektion; om summan av de lägre trovärdiga intervallen för återfall plus recrudescens överstiger 0,7 klassificeras återfallet som ett misslyckande; annars anses klassificeringen osäker. Eftersom det fanns försumbara bevis på recrudescens, är alla misslyckanden i huvudsak återfall.
rapportsammanfattning
ytterligare information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary kopplad till denna artikel.