mot ett integrerat tillvägagångssätt för att förstå mexikansk cavefish evolution

introduktion

mexikanska tetras i floder i Centralamerika och i grottor i centrala Mexiko är samma art: Astyanax mexicanus. De förra är ’vildtyp’ flerfärgade tropiska sötvattensfiskar. De senare är ’naturliga mutanter’ som lever i totalt och permanent mörker, och de saknar ögon och pigmentering (figur 1). De finns i 30 karstgrottor i en begränsad region i Mexiko . De två typerna av morfer kan föda upp och ge en bördig avkomma, och grottfisk från olika grottor är också interfruktbar . Därför, efter en drastisk och plötslig miljöförändring, inträffade deras fenotypiska utveckling snabbt inom cirka 20 000 år och är förmodligen fortfarande pågående. Observera, baserat på morfologiska skillnader, yta och Grotta morfar föreslogs ursprungligen som olika arter och till och med släkte, och den ögonlösa fisken fick namnet Anoptichthys jordani . Speciering mellan de två morferna kan vara på väg , men har inte hänt ännu, baserat på interfertiella kriterier.

A. mexicanus-systemet presenterar många fördelaktiga egenskaper och verkar vara ett enastående modellsystem för att studera evolutionära krafter (distala mekanismer) och evolutionära mekanismer (proximala mekanismer) som ligger bakom morfologiska, beteendemässiga och fysiologiska anpassningar som svar på miljöförändringar. Jämfört med andra fiskar som sticklebacks, Ciklider eller sik som också har genomgått de senaste strålningarna och har väsentligt bidragit till evolutionär biologi , A. mexicanus cavefish genomgick betydande selektivt tryck och extrem morfologisk utveckling. Uppenbara fördelar med tetras är de insikter som kan uppnås för att förstå hur cirkadiska rytmer påverkar fysiologi och hur andra sinnen kan kompensera för synförlust. De beteendemässiga och genetiska baserna för deras till synes enkla kolonisering av grottor—jämfört med andra endemiska fiskarter som lever i mexikanska floder—ibland kallade ’pre-anpassningar’, kan studeras. Dessutom, cavefish-modellen, liksom andra fisk evolutionära modeller, uppfyller förutsättningarna för all forskning: det har gått in i genomtiden , kan uppfödas och manipuleras relativt enkelt och dess befolkningsbiologi har studerats i årtionden .

flera recensioner, inklusive en bok om biologi mexikanska cavefish av bidragsgivare från hela Astyanax vetenskapliga samfundet, har publicerats nyligen , behandlar alla de många aspekter av cavefish evolutionär biologi. Istället för att specifikt granska en aspekt, här kommer vi att fokusera på att kombinera metoder för att bättre förstå cavefish evolution och att belysa evolutionära mekanismer i allmänhet.

mot ett integrerat tillvägagångssätt

forskare av mexikansk grottfisk har olika disciplinära bakgrunder: genetik, utvecklingsbiologi, neurovetenskap, fysiologi, metabolism, genomik, befolkningsbiologi, ekologi, grottbiologi eller Speleologi. Ett integrerat tillvägagångssätt är i huvudsak en tvärvetenskaplig analysmetod, varigenom ett fenomen undersöks från flera vinklar (figur 2). I sticklebacks har till exempel kombinationen av befolkningsbiologi, kvantitativ genetik och utvecklingsbiologi avslöjat påfallande konvergerande processer som förekommer i de icke-kodande regulatoriska sekvenserna av en utvecklingstranskriptionsfaktor (Pitx1) och underliggande morfologisk utveckling (förlust av bäckenrygg) av flera sötvattenpopulationer från Marina förfäder . Här ger vi exempel på frågor som starkt drar nytta av ett integrerat tillvägagångssätt i cavefish-systemet.

(a) utvecklingsbiologi och genetik: ögonutveckling och förlust

en typisk fråga vid gränserna för dessa två discipliner är ögonutveckling och förlust, dvs. mekanismerna för morfologisk utveckling. Problemet undersöktes först genom korsningar mellan yta och grottfisk eller mellan grottfisk med ursprung i olika grottor . F1-hybrider från grottans ytföräldrar har något reducerade men funktionella ögon, vilket indikerar att grottalleler mestadels är recessiva. Ibland utvecklar F1-hybrider som genereras från föräldrar som härrör från olika grottor små ögon, och sådan partiell komplettering antyder att olika gener påverkas i olika grottor, vilket belyser konvergent utveckling . Kvantitativ egenskap loci (QTL) analyser visar att kontrollen av ögonstorlek i F2-familjer är ett komplext drag som involverar 12-15 loci . Som grotta alleler vid varje öga eller lins QTL orsaka storleksminskningar, författarna föreslog att ögonförlust utvecklats genom naturligt urval, snarare än genom drift. En ny studie som undersökte cavefish retinal degeneration i samband med QTL-kartläggning identifierade fyra regioner, var och en involverad i kontrollen av tjockleken på ett distinkt retinalskikt, och i vilka flera kandidatgener, mestadels motsvarande utvecklings transkriptionsfaktorer och regulatorer, identifierades .

ur utvecklingsbiologisk synvinkel utlöses cavefish eye degeneration av den defekta embryonala linsen, som snabbt blir apoptotisk och orsakar kollaps av hela ögat . Linseapoptos beror indirekt på en ökning av SHH (Sonic Hedgehog) signalering från den embryonala mittlinjen . Viktigt är att ökad Shh-signalering också påverkar pleiotropiskt andra vävnader i det framtida huvudet och framhjärnan: käftstorlek och smakknopptal ökas , den olfaktoriska placoden förstoras på bekostnad av linsplacoden , den preoptiska regionen och hypotalamus i framhjärnan förstoras, delvis på bekostnad av ventral näthinnan , och utvecklingen förändras avsevärt . Dessa fynd antydde att indirekt urval kan vara på jobbet under utvecklingsutveckling av ögonförlust hos cavefish, dvs att ögonen skulle gå förlorade som sekundär säkerhetsskada till följd av den konstruktiva utvecklingen av andra fördelaktiga egenskaper. Därför konvergerar Evo-devo-tillvägagångssättet och det genetiska tillvägagångssättet i att föreslå urval som fungerar som en av de distala mekanismerna bakom ögonförlust. Observera att andra bevis från studier av molekylär utveckling av utvecklings transkriptom antyder genetisk drift som en mekanism för ögonförlust: i cavefish, radikala mutationer (dvs. ger upphov till aminosyror med distinkta fysikalisk-kemiska egenskaper i de två morferna) är överrepresenterade i ’ögongener’, vilket kan förklaras av avslappnat urval för syn under evolutionen i frånvaro av ljus . Därför finns det förmodligen två komponenter som ligger bakom ögonförlust i cavefish: urval (direkt eller indirekt) för att förbättra överlevnaden i mörkret och driva genom slumpmässig ackumulering av mutationer i ’ögongener’ som inte är motvalda .

b) utvecklingsbiologi och beteende: lukta, känna och sova

embryogenes fortsätter genom en hierarkisk kaskad av händelser som börjar före fecundation. Förändringar i hjärnform och följaktligen funktion kan uppstå genom naturligt urval som verkar på olika nivåer under embryogenes: modergenprodukter i oocyten, uttryck av morfogener och mönstringsgener och tidpunkt för cellproliferation/differentiering. Uppkomsten av nya beteenden genom utvecklingsvariationer är avgörande för evolutionär strålning . Nya framsteg inom sekvensering, genomredigering och transgenes hjälper till att unravel de molekylära mekanismerna i denna utveckling. Att studera variationer i det regulatoriska genomet och epigenomet inom en snar framtid kommer att belysa mekanismerna som kopplar genfunktion och utveckling av utveckling.

differentiella beteendeprestationer kan härröra från sensoriska specialiseringar som har en utvecklingsbas. Parallellt med ögonregression utvecklade cavefish större olfaktorisk epitel, sensoriska organ specialiserade på detektering av molekyler relaterade till utfodring och reproduktion. Utvidgningen i den embryonala vävnaden som är avsedd som olfaktorisk epitel är resultatet av subtila förändringar i uttrycket av signalmolekylerna Bmp4 och Shh i den embryonala prekordala mesodermen. Parallellt har beteendeanalyser visat grottfiskens anmärkningsvärda luktförmåga . Ökad olfaktorisk känslighet bestäms förmodligen inte bara av det sensoriska organets storlek och utvecklingsplasticitet och förändringar i central bearbetning måste också bidra till denna anpassning .

vissa grottfiskpopulationer har utvecklat ett vibrationsattraktionsbeteende (VAB) mot oscillerande föremål i vattnet, medierat av NeuroMaster i sidolinjen, särskilt de som ligger i det suborbitala ögonområdet . Numeriska skillnader i NeuroMaster uppträder vid larvstadier , men de embryologiska och genetiska baserna för sådana modifieringar förblir okända. Ökat neuromasttal i det optiska området kan bero på ögondegeneration, men detta är oberoende av den pleiotropa Shh-hypersignalen som leder till ögonregression .

en annan beteendeanpassning av cavefish är sömnförlust . Sömn är ett reversibelt tillstånd av förhöjd upphetsningströskel och lugn. Dess varaktighet och intensitet skiljer sig mycket mellan arter, beroende på ekologiska variabler och evolutionär historia . Det regleras av den dagliga ljus-mörka cykeln (frånvarande i grottor), liksom genom sensorisk bearbetning och metabolisk balans . Neuromast överkänslighet är inblandad i sömnförlust hos cavefish . Det hypotalamiska hypokretin / orexinerga systemet har en bevarad roll i regleringen av sömn/vakningscykeln hos ryggradsdjur . Högre nivåer av hypokretinuttryck och antal neuroner rapporterades hos vuxen grottfisk jämfört med ytfisk, och funktionella analyser bekräftade att ökad orexinerg neurotransmission är associerad med sömnförlustfenotypen . Neuroanatomiska variationer i hypokretin neuronal kluster existerar från tidig embryogenes, som härrör från morfogenmoduleringar i slutet av gastrulationen . Utvecklingsmanipulationer som minskar antalet hypokretinneuroner i en vecka gamla larver minskar aktiviteten i dessa larver och efterliknar ytfisk. Detta visar att utvecklingsutvecklingen av hypokretinklustret påverkar grottfiskbeteendet. Variationer i etableringen av andra hypotalamiska neuronala system (neuropeptid Y (NPY), proopiomelanokortin) noterades också, och deras bidrag till beteendeförändringar måste undersökas.

(C) beteende, genetik och funktionell genomik: identifiera mutationer i cavefish

Cavefish visar flera beteendeegenskaper som skiljer sig från ytfisk och dessa verkar vara fördelaktiga för livet i underjordiska livsmiljöer och har troligen valts ut för. Detta innebär att de har en genetisk grund.

QTL-tillvägagångssätt indikerar att förlusten av sömn , förlusten av skolgång , den speciella utfodringsställningen med en 45 kg vinkel mot substratet och VAB har en multigenisk determinism, eftersom F2-fisk som härrör från korsningar mellan två F1-hybrider uppvisar olika nivåer av dessa beteenden. Flera QTL-intervall identifierades, vilket möjliggjorde kartläggning av genomiska regioner associerade med särskilda beteenden. Regionerna relaterade till kontrollen av sömn/lokomotorisk aktivitet och VAB är olika . Dessutom föreslår QTL-analys kandidatgener, såsom den narkolepsiassocierade TP53-inducerbara proteingenen, en potentiell regulator för sömn som ligger i QTL-intervallet identifierat som reglerande lokomotorisk aktivitet .

ibland kan studien av beteendefenotyper själva föreslå kandidatgener. Till exempel föreslog Tinaja cavefish hyperfagi att undersöka leptinvägen, vilket ledde till identifiering av mutationer i Mc4r-genen (melanokortin 4-receptorn). Eller effekten av deprenyl (hämmare av serotoninnedbrytning) på aggressivitet, tillsammans med jämförande neuroanatomiska analyser, involverade det serotonerga systemet i aggressivitetsskillnader mellan de två morferna och identifierade en mutation i Mao (monoaminoxidas) enzym . Därför möjliggör studien av beteendefenotyper, men också neurokemiska och neuroanatomiska studier, bättre inriktning av kandidatgener som är ansvariga för beteendeförändringar mellan de två morferna.

när en kandidatgen har identifierats bör funktionell genomik testa genens roll i beteendekontroll. När cavefish och ytfisk har olika alleler, kors eller genomutgåva av CRISPR/Cas9 kan användas för att infoga en ytallel i cavefish och vice versa. När genen skiljer sig i termer av uttrycksnivå mellan grottfisk och ytfisk kan inaktivering eller överuttryck uppnås. Till exempel är hypokretingenen överuttryckt i grottfisk. Knock-down av sitt uttryck av morpholinos har visat sitt engagemang i sömnförlust i cavefish .

beteendestudier, genetik och funktionell genomik identifierar de genetiska baserna för beteendeförändringar. Sedan kan intressanta bidrag uppstå från befolknings-och fylogeografiska studier för att dra hypoteser om egenskapens evolutionära historia. Till exempel tyder fördelningen av muterade alleler av Mc4r bland grottor och floder på att den härledda allelen kom in i grottan med utgångspunkt från den stående genetiska variationen som finns i ytfisk vid tidpunkten för grottkolonisering (se även 2d i 2D). Observera att genetiska baser är en av flera möjliga proximala orsaker till beteendeskillnaden mellan de två morferna. Vi måste också studera effekterna av miljön ensam (t.ex. frånvaro av ljus, vatten fysikalisk-kemiska parametrar eller trofiskt stöd), vilket motsvarar den potentiella involveringen av fenotypisk plasticitet eller epigenetiska mekanismer.

(d) genomik och befolkningsbiologi: spåra evolutionär historia

grottorna som är värd för grottfisk har en bred fördelning och har grupperats i tre kluster: El Abra, Guatemala och Micos-grupperna. Den evolutionära historien och ursprunget till dessa grottfiskpopulationer är fortfarande dåligt förstådda. Medan ett ganska gammalt ursprung, för miljontals år sedan, av grottfiskpopulationerna i allmänhet citerades i litteraturen, tyder nya analyser och modellering med två oberoende dataset (mikrosatelliter och singelnukleotidpolymorfismer) på att grottfisk invaderade grottor för mindre än 25 000 år sedan . Ett sådant nyligen ursprung bör vara verifierbart och ha intressanta konsekvenser när det gäller befolkningsgenomik. Resultaten bör vara jämförbara med de som erhållits i threespine stickleback-systemet (t.ex.). För det första innebär ett nyligen ursprung och snabb utveckling av grottfisk att fenotypisk utveckling huvudsakligen förlitade sig på fixering av genetiska varianter som redan finns i förfädernas ytpopulation (i motsats till nya mutationer som uppstår, vilket tar mer tid), och många av dem borde fortfarande hittas i den existerande ytfisken. Genomomfattande skanningar bör utföras på befolkningsnivå för att uppskatta delad polymorfism , men vi har redan ett exempel på ett sådant fall: punktmutationen som beskrivs i Mc4r, och ansvarig för ökad aptit hos vissa grottfiskpopulationer, har hittats vid låg frekvens (3%) hos flodboende individer . För det andra innebär ett nyligen Ursprung också att genförlust/pseudogenisering inte borde ha haft tid att inträffa signifikant på ’ögongener’, som inte är motvalda i mörkret. Genomomfattande undersökningar av högkvalitativa genom behövs också för att bekräfta detta, men publicerade data verkar stödja denna förutsägelse: cavefish-kristalliner och opsins visar inte större förlust av funktionsmutationer i sin kodande sekvens, för att exempelvis jämföras med två kristalliner och två opsins som inaktiveras/saknas i det nakna molråttgenomet . Tredje, om cavefish populationer är unga, det bör vara möjligt att hitta spår av urvalsgenomet genom selektiva svep analyser. Selektiv svep är fixeringen av en allel genom urval och fixeringen av neutrala alleler vid nära länkade loci genom genetisk hitchhiking, vilket resulterar i minskad genetisk mångfald runt positionen under urval. Sådana analyser kan endast utföras om valet är nyligen; annars uppstår nya polymorfier med tiden och maskerar det svepade området . Återigen lovar populationsgenomikmetoder, som ett alternativ / komplement till QTL-tillvägagångssätt, att identifiera loci under urval under cavefish fenotypisk utveckling.

(e) från populationsbiologi till beteende och genetik: belyser lokala anpassningar

det finns 30 beskrivna grottpopulationer av A. mexicanus, uppkallad efter grottan där de bor . Alla populationer är blinda och depigmenterade, men dessa slående fenotyper uppnås, åtminstone delvis, genom konvergenser. Den uppsättning gener som är involverade i ögondegeneration är inte identisk i olika grottpopulationer (2a), och mutationerna/deletionerna i Oca2 (okulär och kutan albinism 2) som är ansvariga för albinofenotypen är inte desamma i Molino (Guatemala-gruppen), Pach usci nn eller Japon usci (båda från El Abra-gruppen) grottor . Andra, mindre uppenbara fenotyper visar också betydande variationer bland grottor. VAB är närvarande i Pach Actubn och Sabinos cavefish (båda från El Abra-gruppen), men har inte samma föräldragenetiska determinism, fader-eller moderarv, i dessa två populationer . Dessutom visar vissa grottpopulationer VAB (Pach Acubern, Sabinos, Piedras) men vissa gör det inte (Molino) . Slutligen visar en liten andel ytfisk en svag form av VAB, vilket tyder på att ytförfäderna anpassades till grottor genom positivt urval för VAB, följt av fortsatt urval för förstärkning av detta beteende och dess underliggande sensoriska receptorer, neuromasterna . Liknande fenotypiska variationer finns för sömn, aggressivitet eller utfodringsbeteende bland grottpopulationer. Varierande grader av evolutionär härledd sömnreduktion beskrivs i Pach Sabinos -, Tinaja -, Molino -, Sabinos-och Chica-populationer , men denna funktion är beroende av sensoriska ingångar från sidolinjen endast i Pach Saborin-populationen , vilket indikerar att fenotypen kan ha uppstått av olika mekanismer. Förlusten av territoriell och hierarkisk aggressivitet—ett ytfiskmärke—beskrivs i Pach Auc6n cavefish, medan Molino cavefish har bevarat en viss grad av aggressivitet , och denna fenotypiska skillnad kan vara relaterad till närvaron eller frånvaron av en MAO-mutation i genomerna i dessa två populationer . Den ökade aptiten hos Tinaja cavefish ses inte i Pach Baccarat cavefish , möjligen relaterad till närvaron eller frånvaron i deras Genom av muterade Mc4r-alleler . Dessa exempel belyser de komplexa genotyp / fenotypförhållandena och det komplexa ursprunget till Astyanax cavefish populationer. Varje grotta verkar vara ett speciellt fall när det gäller fenotyp och kombinationer av alleler, och det möjliga scenariot för att förklara allelfördelningar när det gäller ursprung, migreringar och genflöden kommer att kräva ytterligare ansträngningar inom befolkningsbiologi och befolkningsgenomik. Dessutom måste effekterna av de specifika miljöer som finns i varje grotta analyseras, eftersom den underskattade mångfalden i olika grottor (t. ex. närvaro / frånvaro av fladdermöss, rovdjur eller ytfisk, trofiskt stöd, vatten som kommer in genom översvämning eller perkolering, figur 1) kan mycket väl bidra till valet och fixeringen av olika alleler, beroende på lokala ekologiska förhållanden.

(f) tillbaka till fältarbete och ekologi hos arten

trots att 30 grottfiskgrottor beskrivs och är relativt tillgängliga har få laboratoriefynd bekräftats av experiment i naturen. Validering av tolkningar genom att bedöma vild livscykel och grottekologi är viktigt för att undvika mis-/övertolkningar och för att förstå ekologisk mångfald av grottor, som kan vara relaterade till genetiska och beteendemässiga skillnader (figur 1).

underjordiska livsmiljöer får energi från externa källor (fladdermuskolonier, insekter, ström och perkoleringsvatten laddat med mikrofauna, partiklar och organiskt kol) . Livsmedelsförsörjningen varierar beroende på säsong och ort, därav det variabla lera kolinnehållet i olika grottor . Ändå, undersökning av vilda cavefish gut innehåll som innehåller bat guano, lera, plankton, insekter och kongener fragment i olika årstider föreslog välnärda vuxna med icke-specialiserade kost regim i chica, Sabinos, subterr Askorbneo och Pach Askorbn grottor . Pach Baccarat cavefish tillväxttakt är jämförbar med deras ytkonspecifics och friska ungdomar med matsmältningssystem som innehåller ett stort antal och sorter av mikro-Leddjur finns, vilket tyder på utmärkta jaktfärdigheter i blind yngel, som i laboratorieförhållanden . Subterr askorneo vild cavefish är mer mottagliga för luktstimuli än ögonhybrider som sambor i grottan , vilket tyder på att luktfärdigheter som beskrivs i laboratoriet också är på jobbet i den naturliga miljön. VAB-eller akustiska förmågor bör undersökas också i flera grottor, eftersom matfärdigheter kan bero på grottans ekosystem.

laboratorie-och vildfiskfisk har högre fettinnehåll än ytfisk (s r Millenium 2004-2018, personliga observationer). Cavefish metabolism modifieras också på cirkadisk nivå. I vild chica cavefish, men inte i försöksdjur av samma ursprung, är låga uttrycksnivåer av den oscillerande genperioden1 associerade med avskaffade rytmiska funktioner, vilket tyder på att ’cavefish upplever permanent ljus istället för evigt mörker’ . Förändringar av dygnsrytmen är ett vanligt drag hos grottdjur och kan bidra till att spara energi genom att sänka metabolisk efterfrågan . Slutligen har hypotesen om en genetisk begränsning i kroppsstorlek (vild Pach Baccarat cavefish verkar ha mindre maximala storlekar än Tinaja och subterr Baccarat) för att sänka energiförbrukningen och matbehovet ännu inte undersökts . Dessa studier på vilda exemplar upplyser de många modifieringarna i komplexa funktioner som kan ha utvecklats i olika grottpopulationer.

longitudinella undersökningar behövs också för att bättre förstå cavefish livsstil. Cavefish häckar lätt i laboratorier, men lite är känt om deras reproduktionscykel och parningsbeteende i naturen. I Chica cave, broar beskrev stora kvinnor med ägg och små exemplar som han uppskattade vara mindre än en månad gammal, som rapporterats i . Torrsäsongen föreslogs motsvara groddfiskens uppfödningsperiod, vilket överensstämmer med rapporten från ungdomar i Pach Aucorin i mars 2016 . Om bekräftas, detta skulle föreslå en ’synkroniserad’ häckningssäsongen från söder till norr om Sierra-skiljer sig från Nordamerika Amblyopsid cavefish, som häckar efter vårfloder som införa mat i grottor . Som laboratorie lek i Astyanax cavefish och ytfisk induceras av variationer i vattentemperaturen , efter dygnsrytm och året klimatvariationer i grottor kommer att vara avgörande.

trots de uppenbara svårigheterna med att utföra fältförsök, krävs ytterligare fältarbete för att gå mot ett helt integrerat och tvärvetenskapligt tillvägagångssätt för att bättre förstå grottfiskutveckling. I synnerhet är det viktigt att ta hänsyn till de specifika ekologiska egenskaperna hos de olika grottorna eller de olika dammarna i en enda grotta. Detta skulle möjliggöra etablering av mesokosm för att studera grottfiskbeteende och livsstil under mer naturliga förhållanden, och även för att utföra mer långsiktiga konstgjorda utvecklingsstudier på ytfisk.

slutsats

denna översyn belyser vikten av att överväga cavefish evolution från flera vinklar. Ett sådant företag kan ibland verka långt och svårt, men vi tror att det kommer att visa sig vara givande och insiktsfullt att förstå hemligheterna för grottfiskanpassningar till deras miljö. Den enorma skillnaden i miljöförhållanden som upplevs av yt-och grottmorfer, förekomsten av flera, snabbt utvecklade grottpopulationer, de olika fenotyper som cavefish uppvisar på morfologiska, fysiologiska och beteendemässiga nivåer, den experimentella amenability som arten uppvisar gör mexikanska tetras primära fiskmodeller för att svara på bredare evolutionära frågor. Stora forskningsriktningar kommer att omfatta dechiffrera de genetiska och utvecklings evolutionära processer, inklusive typ och antal involverade gener, eller om kodning eller reglerande sekvenser är på spel för morfologisk utveckling. Fascinerande frågor inkluderar också konvergensmekanismerna, eller hur liknande resultat kan bero på olika mekanismer, som belyser kraften i ’genetisk tinkering’ i evolutionen .

datatillgänglighet

den här artikeln har inga ytterligare data.

Författarbidrag

alla fyra författarna skrev recensionen.

konkurrerande intressen

vi förklarar att vi inte har några konkurrerande intressen.

finansiering

arbetet i gruppen stöds av CNRS, FRM, UNADEV-AVIESAN, IDEEV och ett Ecos-Nord Fransk-mexikanskt utbytesprogram.

fotnoter