Tvådimensionell polyakrylamidgelelektrofores (2D-sida): framsteg och perspektiv

introduktion

de senaste 25 åren, och särskilt det senaste decenniet, har bevittnat en ökad ansträngning för att utveckla tekniker som kan identifiera och kvantifiera ett stort antal proteiner uttryckta i ett cellsystem (dvs. proteomen) i hopp om att upptäcka sjukdomsbiomarkörer, kartlägga proteinkretsar eller identifiera nya fosforyleringsställen, till exempel. Proteomets komplexitet har gjort att utvecklingsmetoder för effektiv separation och känslig detektion av proteiner är en kritisk komponent i denna ansträngning. Fortsatta framsteg inom masspektrometri (MS) – teknik har möjliggjort detektering av proteiner med mycket högre hastighet och känslighet än tidigare möjligt. Även banbrytande MS kan emellertid inte karakterisera alla komponenter i ett komplext proteom. Forskare tar ett” divide and conquer ” – tillvägagångssätt för att karakterisera proteomer, genom att de försöker temporärt begränsa antalet proteiner som masspektrometern uppmanas att analysera. Genom att sprida ut proteomet kommer fler proteiner i slutändan att analyseras inom ett individuellt experiment.

för att separera proteomer har forskare använt elektroforetisk och kromatografisk teknik, separat och i kombination, och både offline och online. Även om dessa ansträngningar kan resultera i separation och identifiering av tusentals proteiner, kan ingen enskild metod lösa alla proteiner i ett proteom på grund av deras stora antal och koncentrationsdynamiska intervall. Separationer med en dimension är otillräckliga för att effektivt lösa komplexa proteinblandningar. Detta faktum erkändes för över ett halvt sekel sedan av Smithies och Poulik (1), som erkände att en kombination av två elektroforetiska processer på en gel i rät vinkel borde ge en mycket större grad av upplösning än vad som är möjligt med antingen separat. De två elektroforetiska processerna är upplösning med molekylstorlek och fri lösningsmobilitet på en stärkelsegel. Deras förutsägelse fortsätter att bevisas sant och har legat till grund för att utveckla ortogonala flerdimensionella metoder för separation av komplexa blandningar, inte bara genom gelelektrofores utan också genom kromatografi och kapillärelektrofores.

för att korrekt förstå de framsteg som gjorts i tvådimensionell sida (2D-sida), måste man gå tillbaka mycket längre än ett kvarts sekel. 1930 introducerade Tiselius den rörliga gränsmetoden som ett analytiskt verktyg för att studera elektrofores av proteiner (2). Sedan hans banbrytande arbete har olika former av elektrofores använts för separation av komplexa blandningar av proteiner, var och en med förbättrad upplösning. Så tidigt som 1962 demonstrerade Raymond och Aurell (3) de signifikanta icke-linjära effekterna av gelkoncentration på den elektroforetiska rörligheten hos proteiner genom att använda 2-D-elektrofores med olika akrylamidgelkoncentrationer för att separera serumproteiner. Två år senare visade Raymond (4) överlägsenheten hos plana plattgeler jämfört med cylindriska rörgeler. Till exempel ger den plana plattan maximal ytarea för kylning av gelen; de resulterande mönstren är lättare att kvantifiera i standardregistreringsdensitometrar; ett stort antal prover kan bearbetas med en enda gelplatta, vilket underlättar den direkta jämförelsen av prover bearbetade under identiska förhållanden; och viktigast av allt tillåter den platta plattan applicering av 2-D-separationer. Dessa insiktsfulla preferenser har visat sig vara sanna och praktiseras idag i många bioanalytiska laboratorier.

en annan framsteg i 2-D-gelavskiljningar introducerades 1972 av Wright (5), som använde en 4,75% (2% tvärbindning) polyakrylamidgelkolonn i den första dimensionen, som sedan avlägsnades från glascylindern och lades på den övre kanten av en 2% gradientplatta. Efter elektrofores placerades gelplattan i en färgningslösning, vilket resulterade i visualisering av 112 lösta humana serumproteiner.

dessa nya tillvägagångssätt löste endast ett litet antal proteiner, främst de vanligaste proteinerna i en cell eller serumproteom. Introduktionen av 2D-sida 1975 av O ’ Farrell (6) för att separera cellulära proteiner under denatureringsbetingelser möjliggjorde upplösningen av hundratals proteiner. Principen som tillämpades var mycket enkel: proteiner löstes på en gel med användning av isoelektrisk fokusering (IEF), som separerar proteiner i den första dimensionen enligt deras isoelektriska punkt, följt av elektrofores i en andra dimension i närvaro av natriumdodecylsulfat (SDS), som separerar proteiner enligt deras molekylmassa. O ’ Farrells metod är verkligen grunden för modern 2D-sida, som snabbt anpassades och allmänt accepterades av andra forskare. Anderson och Anderson (7) använde 2D-sida för analys av humana plasmaproteiner. De kunde separera och upptäcka cirka 300 distinkta proteinfläckar vid färgning. Till skillnad från O ’ Farrell separerade Manabe (8) humana plasmaproteiner med 2D-sida utan denatureringsmedel. Cirka 230 proteinfläckar kunde observeras på gelen; emellertid smutsades fläckarna och löstes inte väl.

introduktion av immobiliserade pH-gradienter

som nämnts ovan innefattar 2D-sida IEF i den första dimensionen, följt av SDS-sida i den andra dimensionen. Sedan Kolin infördes 1954 (9) har IEF genomgått flera framsteg. Den första dimensionen utförs i polyakrylamidgelstavar som bildas i glas-eller plaströr och innehåller amfolyter som bildar en pH-gradient i ett elektriskt fält. Dessa stavar var historiskt irreproducerbara, instabila och svåra att arbeta med. Införandet av immobiliserade pH-gradienter (IPGs) av Bjellqvist et al. (10) hade en betydande inverkan på användningen av IEF för att separera komplexa blandningar över ett brett pH-område. IPGs möjliggjorde bildandet av stabila och reproducerbara pH-gradienter som kan fokusera sura och basiska proteiner på en enda gel framställd med breda pH-gradienter. I IPGs är bäraramfolyterna fästa vid akrylamidmolekyler och gjutna i gelerna för att bilda en fast pH-gradient. Fixering av lutningen förhindrar drift i gelen och säkerställer också att de kan gjutas på ett effektivt och reproducerbart sätt. Med hjälp av smala IPG-remsor kunde ett större antal proteiner separeras än vad som hade varit möjligt med standard 2D-sida eftersom ett smalare pH-intervall spreds ut över ett större fysiskt avstånd. Denna spridning tillät proteiner med liknande isoelektriska punktvärden (pI) att separeras med högre upplösning. För att illustrera denna punkt, Hoving et al. utvecklat en 2D-sidig metod där de tillämpade smala IPG-remsor i den första dimensionen (11). IPG-remsorna var typiskt 1-3 pH U breda och överlappade varandra med minst 0,5 pH U. sex IPG-remsor som täckte pH-intervallet 3,5 till 10 användes. Proteiner från en B-lymfomcellinje applicerades på varje remsa och separerades med användning av IEF. Varje remsa applicerades sedan på en individuell SDS-PAGE gelplatta och proteiner separerades i den andra dimensionen baserat på deras molekylvikt. Cirka 5000 distinkta fläckar detekterades med hjälp av de sex IPG-remsorna, jämfört med 1500 fläckar detekterade med en enda IPG-remsa med ett pH-intervall på 3-10 och en enda standard 2D-sidig gelplatta. Wildgruber et al. (12) jämförde användningen av 3 IPG–remsor med pH-intervall på 4-5, 5-6 och 5,5-6,7 mot geler som körs med IPG-remsor med pH-gradientintervall på 3-10 och 4-7. De kunde detektera 2.3 och 1.6 oc mer proteinfläckar med hjälp av tre IPG-remsor med smal räckvidd än med de två bredare IPG-remsorna (3-10 respektive 4-7).

medan den högre upplösningen som kan erhållas med flera överlappande smala IPGs möjliggör identifiering av fler proteiner, kräver varje smal remsa en separat gelplatta och en viss mängd av samma prov som ska laddas på vardera. Detta krav innebär att om provvolymen eller koncentrationen är begränsad kanske ett sådant experiment inte är möjligt. För begränsade prover bör ett bredare pH-intervall eller ett minimalt antal IPG övervägas.

tvådimensionell differentiell In-gelelektrofores (2D-DIGE)

målet att separera proteiner med 2D-sida är dubbelt: i) identifiera nya proteiner och ii) mäta deras relativa överflöd mellan jämförande prover. En fördel med 2D-sida som en separationsteknik är att det inte bara löser ett stort antal proteiner, men färgning av dessa proteiner gör det möjligt att kvantifiera de relativa överflödena av proteinerna. Till exempel laddas proteiner extraherade från två serumprover (friska och sjuka) vardera på en separat gelplatta. Efter färgning justeras proteinfläckarna och skannas för att mäta deras individuella intensiteter. Medan många framsteg inom mjukvarujusteringsverktyg har gjorts har det varit utmanande att säkerställa direkt jämförelse mellan två separata geler. Utvecklingen av 2-D differentiell in-gelelektrofores (DIGE) 1997 övervann denna begränsning genom att tillåta upp till tre distinkta proteinblandningar att separeras inom en enda 2D-sidig gel (13). I ett typiskt 2D-DIGE-experiment, proteiner extraherade från tre olika prover, friska, sjuka och intern kontroll (ett poolat prov bildat genom att blanda lika stora mängder av proteinerna extraherade från de friska och sjuka proverna), är kovalent märkta, var och en med ett cyanin fluorescerande färgämne som har en annan excitation och emissionsvåglängd. Proverna är migreringsmatchade, så att samma protein märkt med någon av färgämnena kommer att migrera till samma position på gelen. De cyaninfärger som har använts är: 1-(5-karboxi-pentyl)-1′-propylindokarbacyaninhalogenid N-hydroxisuccinimidylester (Cy3); 1-(5-karboxipentyl)-1′-metylindodikar-bacyaninhalogenid N-hydroxisuccinimidylester (Cy5); och 3-(4-karboximetyl)fenylmetyl-3′-etyloxakarbacyaninhalogenid N-hydroxisuccinimidylester (cy2). Lika koncentrationer av de olika märkta proteinerna och kontrollprovet blandas, appliceras på en enda gelplatta och separeras med 2D-sida. Kontrollprovet fungerar som en intern standard, vilket möjliggör både Inter – och intra-gel matchning. Kontrollprovet ska innehålla varje protein som finns i alla prover i ett experiment. Detta innebär att varje protein i experimentet har en unik signal i den interna standarden, som används för direkta kvantitativa jämförelser inom varje gel och för att normalisera kvantitativa överflödesvärden för varje protein mellan geler. Skanning av gelen vid de specifika exciteringsvåglängderna för varje färgämne, med användning av en fluorescenskamager, möjliggör visualisering av de differentiellt märkta proteinerna (Figur 1). Bilderna slås sedan samman och analyseras med hjälp av bildprogramvara, vilket gör det möjligt att jämföra skillnader mellan överflödet av proteiner. Värdet i DIGE eliminerar eventuella fel relaterade till gel felinriktning och säkerställer korrekt kvantifiering (14).

proteiner av intresse skärs ut från gelen, proteolytiskt digereras och identifieras med användning av MS. Eftersom det utförs med en enda gelplatta kräver 2D-DIGE 50% färre geler, vilket gör det mer ekonomiskt och skillnader i proteinuttryck mellan två olika prover av proteiner lättare att jämföra och mer exakt avbildas. Dessutom krävs mindre tid för att detektera proteinfläckarna eftersom märkningsreaktionen i DIGE är snabbare än visualisering med färgningsmetoder. När det finns ett behov av att jämföra proteinexpressionsnivåerna för två olika prover är DIGE den valda metoden (15).

styrkor och svagheter i 2D-sida

elektrofores är en etablerad teknik som har genomgått flera framsteg som har förbättrad upplösning, detektion, kvantifiering och reproducerbarhet. 2-D SDS-PAGE och 2D-DIGE tillvägagångssätt för proteinprofilering är tillgängliga och ekonomiska metoder som har hög upplösningsförmåga och möjliggör detektering av hundratals proteiner på en enda gelplatta. Även om Reproducerbarhet har varit ett problem med 2D-sida, särskilt vid profilering av två proteinblandningar, har det förbättrats avsevärt med användning av 2D-DIGE. Upplösningen har förbättrats genom introduktionen av IPGs, vilket gör det möjligt för analytikern att skräddarsy pH-gradienten för maximal upplösning med hjälp av ultrazoom-geler med ett smalt pH-gradientområde. Med modern 2D-sida är det inte ovanligt att lösa två proteiner som skiljer sig i pI med 0.001 U.

även om 2D-sidan har begränsats av dess oförmåga att lösa proteiner som är för basiska eller för sura, för stora eller för små, minskar denna begränsning kontinuerligt. Till exempel kan separationen av basiska proteiner analyseras med användning av IPGs i pH-området 4-12. Separationsvetenskap utvecklas alltid, och det kommer inte att dröja länge innan de återstående problemen med gelelektrofores löses tillräckligt.

introduktionen av 2D-DIGE bidrog oerhört till att lösa problem med reproducerbarhet och kvantifiering. Användningen av bildspelare och datorer möjliggör inte bara snabb datautvinning, förvärv och analys utan även spotdetektering, normalisering, proteinprofilering, bakgrundskorrigering och rapportering och export av data. Som en separations -, detektions-och kvantifieringsteknik är 2D-DIGE ett viktigt verktyg, särskilt för kliniska laboratorier som är involverade i bestämning av proteinexpressionsnivåer och sjukdomsbiomarkörupptäckt. När absolut biologisk variation mellan prover är huvudmålet, som i biomarkörupptäckt, är 2D-DIGE den metod du väljer.

även om det har skett betydande framsteg i nongel (eller lösningsbaserade) metoder för koppling av fraktioneringsmetoder direkt online med MS-analys, har 2D-PAGE förblivit en populär teknik för att genomföra proteomiska studier. Även om 2D-sida, som alla fraktioneringsschema, har sina fördelar och nackdelar, är det ingen tvekan om att det kommer att förbli en viktig teknik för karakterisering av proteomer under många år framöver.