faktorer, der binder til pro-COL1A2 proksimal promotor
flere funktionelle cis-virkende elementer er blevet identificeret i den cirka 400-BP proksimale promotor af musens pro-Col1a2-gen (154-2350 bp) og den humane minimale sekvens mellem 152 og 2378 bp. Den første transkriptionsfaktor, der blev fundet at binde til denne promotor, var det allestedsnærværende CCAAT-bindende protein CBF. Denne transkriptionsfaktor er dannet af tre separate underenheder, der hedder A, B og C, som alle er blevet klonet og sekventeret (Maity og de Crombrugghe, 1998). Alle tre underenheder er nødvendige for CBF at binde til sekvensen indeholdende CCAAT-boksen placeret mellem 284 og 280 og aktivere transkription i både humane og musegener (se Fig. 13.2 B). In vitro-data antyder, at A–og C-underenhederne først associeres til dannelse af et A-C-kompleks, og at dette kompleks derefter danner et heteromert molekyle med B-underenheden (Sinha et al., 1995). Mutationer i CCAAT-boksen, der forhindrer binding af CBF, reducerer transkriptionsaktiviteten af pro-Col1a2 proksimal promotor tre til fem gange i forbigående transfektionseksperimenter af fibroblastiske cellelinjer (Coustry et al., 1995). Oprenset CBF såvel som CBF sammensat af dets tre rekombinante underenheder aktiverer også pro-Col1a2-promotoren i cellefri nukleare ekstrakter, der tidligere er udtømt af CBF (Coustry et al., 1995). To af de tre underenheder af CBF indeholder transkriptionelle aktiveringsdomæner. For nylig antydede en enkelt substitution af T til en A in vivo i nærvær af en opstrømsforstærker af den humane sekvens, at CBF er involveret i mønster af kollagen type i-ekspressionen i dorsoventral såvel som den rostrocaudale akse af musehudfibroblaster (Tanaka et al., 2004).
ud over bindingsstedet for CBF identificerede fodtryksforsøg og gel-shift-undersøgelser andre bindingssteder i de første 350 bp af musens Pro-Col1a2-promotor. 2160 bp (mellem 2176 og 2152 bp) og 2120 bp (mellem 2131 og 2114 bp) har vist sig at interagere med DNA-bindende proteiner ved fodaftrykseksperimenter og gel-shift-analyser., 1996). En sletning i musepromotoren, der omfattede disse tre fodtrykte sekvenser, afskaffede fuldstændigt transkriptionsaktiviteten af pro-Col1a2 proksimal promotor i forbigående transfektionsforsøg ved anvendelse af fibroblastiske cellelinjer. De tilsvarende regioner i den humane Pro-COL1A2-promotor blev også beskyttet i In Vivo-og in vitro-fodaftryksforsøg (Ihn et al., 1996) og bundne transkriptionsaktivatorer. Imidlertid har gel-shift-analyser udført under anvendelse af den humane Pro-COL1A2-promotor antydet, at et cis-virkende element placeret ved 2160 bp repræsenterer et repressorelement (Ihn et al., 1996), hvilket antyder, at interaktioner mellem proteiner, der interagerer med aktivatorelementerne ved 2300, 2125 og 280 bp, og proteiner, der binder til et repressorelement ved 2160 bp, regulerer dette gen. For nylig blev det vist, at CUKS1, et ccaat-fortrængningsprotein, er forbundet med reduceret ekspression af type I-kollagen både in vivo og in vitro, og at forbedring af ekspressionen af CUKS1 resulterer i effektiv undertrykkelse af type i-kollagen ved at interferere med CBF-binding (Fragiadaki et al., 2011).
Sp1 og Sp3 har vist sig at binde TCCTCC-motivet placeret mellem 2123 og 2128 bp; begge transkriptionsfaktorer aktiverer denne promotor (Ihn et al., 2001) (se Fig. 13.2 B). Desuden binder proteiner, der binder til de to proksimale segmenter, også til det mest opstrøms GC-rige segment ved 2300 bp med undtagelse af CBF, hvilket antyder en redundans blandt funktionelt aktive DNA-segmenter af pro-COL1A2 proksimal promotor.
TGF Krishn formidler sin virkning i den menneskelige promotor gennem kombinationen af den allestedsnærværende transkriptionsfaktor Sp1, Smad3/4-komplekset og coaktivatorerne p300/CREB-bindende protein (CBP) i det, der kaldes et TGF-Krish-responsivt element (t-Krishn) (Jhang et al., 2000). Dette segment indeholder tre GC-rige motiver mellem 2330 og 2255, der er i stand til at binde Sp1, CCAAT/enhancer-bindende protein (C/EBP), aktivatorprotein 1 (AP1) og Smad-komplekser (Chen et al., 1999, 2000A, b; Kanamaru et al., 2003; Tamaki et al., 1995; Chang et al., 2000). Interaktion mellem disse nukleare faktorer er synergistisk og kræver binding af Sp1 og Smad3/4 til henholdsvis de GC-rige elementer og det nedstrøms cagac Smad-sted (Ghosh et al., 2000; Poncelet og Schnaper, 2001; Jang et al., 2000). Ved århundredeskiftet var der en stor debat om, hvorvidt smad ‘ er er vigtigere end AP1 i den proksimale promotor. Dette blev løst omkring 10 år senere, da det blev vist, at TGF kursist også aktiverer COL1A2-genet via en ikke-kanonisk (Smad-uafhængig) signalvej, som kræver forstærker/promotorsamarbejde, der involverer udveksling af C-Jun/JunB transkriptionsfaktor belægning af et kritisk forstærkersted, hvilket resulterer i stabilisering af forstærker/promotor sammenblanding (Ponticos et al., 2009). En rapport, der undersøger virkningerne af hypoksi og TGF-kur på COL1A2-genet, har tilføjet Smads ‘ potentielle rolle, især Smad3, i reguleringen af kollagenekspression. Disse undersøgelser i humane mesangiale celler antyder, at under hypoksiske forhold og i nærvær af TGF-kur, kan hypoksi-inducerbar faktor 1-kur (HIF-1-kur) og Smad3 danne transkriptionskomplekser og fortrinsvis forbedre bindingen til et af de tre hypoksiresponselementer i den humane COL1A2-promotor ved position -335 bp (Baumann et al., 2016). Forfatterne antyder, at denne nye interaktion giver en mekanisme, der tegner sig for den synergi, der observeres mellem HIF og TGF Kurt i nyrefibrose.
TNFa og interferon-lolit (IFN-lolit) undertrykker produktionen af matricer. I modsætning til det enkelte DNA-element, der medierer TGF-Kurtis-stimulering af COL1A2-proksimal promotor, har både TNFa og IFN-larr vist sig at hæmme COL1A2-transkription ved at interferere med dannelsen af det TGF-Kurr-inducerede kompleks og ved at stimulere interaktionen mellem negative faktorer med responsive DNA-elementer placeret 5′ og 3′ af det. Dette såkaldte” cytokinresponsive element ” spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af homeostase. Involvering af AP1 og NF-kB ved transduktion af den inhiberende virkning af TNFa på COL1A2-genekspression er blevet vist ved anvendelse af udødelige fibroblaster fra mus, der mangler enten AP1-aktivatoren Jun N-terminal kinase 1 (JNK1) eller NF-kB essentiel modulator NEMO. Specifikt forhindrede tabet af JNK1 TNFa-antagonismen af TGF-kur, men bevarede TNFa-inhibering af konstitutiv COL1A2-ekspression. TGF-kristiantagonisme ved TNFa involverer jnk1-phosphorylering af c-jun, hvilket fører til off-DNA-konkurrence af sidstnævnte molekyle for Smad3-binding til det beslægtede DNA-sted og/eller for interaktion med P300/CBP-coaktivatorer (Kouba et al., 1999; Verrecchia et al., 2001, 2002).
Binding af IFN-Release til dets receptorer fører til tyrosinphosphorylering af janus kinase (JAK) tyrosinkinaser, og dette resulterer igen i signaltransducer og aktivator af transkription (STAT1) phosphorylering. I COL1A2 resulterer STAT1-aktivering i konkurrence med Smad3 om interaktion med p300/CBP (Inagaki et al., 2003). Derudover kan JAK1 også aktivere transkriptionsfaktor y-boks bindingsfaktor (YB-1); denne aktivering resulterer i både inhibering af konstitutiv promotoraktivitet gennem YB-1-binding af 2125tc-boksen og antagonisme af TGF-Kurssignaler gennem YB-1-konkurrence med Smad3 og/eller p300/CBP (Ghosh et al., 2001; Higashi et al., 2003). For flere detaljer, se “vækstfaktorer” og ” cytokiner.”
Est1/Fli1 har også vist sig at binde den samme sekvens med modsatte virkninger på kollagen type i-transkription. En funktionel Ets-transkriptionsfaktor blev identificeret i COL1A2 i nærheden af Sp1-steder. Ets1 stimuleret, hvorimod Fli1 hæmmet, promotor aktivitet. SP1-binding var afgørende for inhibering af Fli1. Desuden førte overekspression af Fli1 i dermale fibroblaster til et fald i COL1A2 mRNA og proteinniveauer., 2001). Desuden fører TGF-behandling af dermale fibroblaster til dissociation af ets1 fra CBP/p300-komplekserne og ændrer deres respons på TGF-Kurt til fordel for nedbrydning af matricen., 2002).
desuden har et CpG–motiv ved 17 bp vist sig at være fortrinsvis methyleret og bundet af rfks-proteiner i celler, der erhverver en kollagen i-negativ tilstand. Celletransfektionseksperimenter i forbindelse med DNA-bindingsassays har tildelt positive eller negative egenskaber til hvert af proteinerne, der binder til den proksimale promotor af pro-COL1A2 (Sengupta et al., 2002). Graden af methylering på 17 CpG-stedet har på den anden side vist sig at modulere bindingsaffiniteten af RFK-proteiner og følgelig deres evne til at nedregulere promotoraktivitet ved at rekruttere associerede proteiner, der interfererer med samlingen af positivt virkende transkriptionskomplekser., 2003, 2004).