Codon brug og organisering af cellens cytoplasma
fordi den genetiske kode er overflødig, udviser kodningssekvenser meget variable mønstre for kodonbrug. Hvis der ikke var nogen bias, bør alle kodoner for en given aminosyre anvendes mere eller mindre ens. Generne af B. subtilis er opdelt i tre klasser på baggrund af deres codonbrugsforstyrrelse. En klasse omfatter hovedparten af proteinerne, en anden består af gener, der udtrykkes på et højt niveau under eksponentiel vækst, og en tredje klasse med A+T-rige kodoner svarer til dele af genomet, der er blevet udvekslet vandret. Hvad er kilden til sådanne forstyrrelser? Tilfældige mutationer forventes at have udjævnet eventuelle forskelle, men dette er ikke tilfældet. Der er også systematiske effekter af kontekst, hvor nogle DNA-sekvenser begunstiges eller vælges imod.
cytoplasmaet i en celle er ikke et lille reagensglas. Et af de mest forvirrende træk ved organisationen af cytoplasmaet er, at det rummer tilstedeværelsen af et meget langt trådlignende molekyle, DNA, som transkriberes for at generere et væld af RNA-tråde, der normalt er så lange som længden af hele cellen. Hvis mRNA-molekyler blev efterladt fri i cytoplasmaet, ville alle slags knyttede strukturer opstå. Der må derfor eksistere nogle organisatoriske principper, der forhindrer mRNA-molekyler og DNA i at blive viklet ind. Flere modeller, understøttet af eksperimenter, postulerer et arrangement, hvor transkriberede regioner er til stede ved overfladen af en kromoid på en sådan måde, at RNA-polymerase ikke behøver at omskrive dobbeltspiralen under transkription. Opdeling er vigtig selv for små molekyler, på trods af at de hurtigt kan diffundere. I en B. subtilis-celle, der vokser eksponentielt i rigt medium, optager ribosomerne mere end 15% af cellens volumen. Cytoplasmaet er derfor et ribosomgitter, hvor de lokale diffusionshastigheder for små molekyler såvel som makromolekyler er relativt langsomme. På samme måde er den beregnede proteinkoncentration af cellen ca. 100-200 mg ml-1, en meget høj koncentration.
translationsmaskineriet kræver en passende pulje af forlængelsesfaktorer, aminoacyl-tRNA-syntetaser og tRNA ‘ er. Når man tæller antallet af tRNA-molekyler ved siden af et givet ribosom, konceptualiserer man et lille, endeligt antal molekyler. Som en konsekvens er et oversættende ribosom en tiltrækker, der virker på en begrænset pulje af tRNA-molekyler. Denne situation tilvejebringer en form for selektivt tryk, hvis resultat ville være tilpasning af kodonbrugsforstyrrelsen af den oversatte meddelelse som en funktion af dens position inden for cytoplasmaet. Hvis bias ved brug af kodon skulle ændre sig fra mRNA til mRNA, ville disse forskellige molekyler ikke se de samme ribosomer i løbet af livscyklussen. Især hvis to gener havde meget forskellige kodonforbrugsmønstre, ville dette forudsige, at de tilsvarende mRNA ‘ er ikke dannes inden for den samme sektor af cytoplasmaet.
når mRNA-tråde kommer ud af DNA, bliver de forlovet af ribosomets gitter, og de skralder fra det ene ribosome til det næste, som en tråd i en trådtegningsmaskine (bemærk, at dette er nøjagtigt modsat visningen af oversættelse præsenteret i lærebøger, hvor ribosomer formodes at rejse langs faste mRNA-molekyler). I denne proces syntetiseres spirende proteiner på hvert ribosom og spredes gennem cytoplasmaet ved den lineære diffusion af mRNA-molekylet fra det ene ribosom til det næste. Men når mRNA frigøres fra DNA, skal transkriptionskomplekset undertiden bryde op. Broken mRNA er sandsynligvis et farligt molekyle, fordi det, hvis det oversættes, ville producere et afkortet protein. Sådanne proteinfragmenter er ofte giftige, fordi de kan forstyrre arkitekturen af multisubunit-komplekser (dette forklarer, hvorfor mange nonsensmutanter er negative dominerende snarere end recessive). Der findes en proces, der håndterer denne form for ulykke i B. subtilis. Når et for tidligt afsluttet mRNA-molekyle når sin ende, stopper ribosomet med at oversætte, adskiller sig ikke og venter. Et specialiseret RNA, tmRNA, som foldes og behandles i sin 3′ ende som en tRNA og ladet med alanin, kommer ind, indsætter sin alanin ved C-terminalen af det spirende polypeptid og erstatter derefter mRNA ‘ et i et ribosome, hvor det oversættes som ASFNVVALAA. Denne hale er et proteinmærke, der derefter bruges til at lede det til et proteolytisk kompleks (ClpA, CLP), hvor det nedbrydes.
organiseringen af ribosomgitteret, koblet til organiseringen af kromoidens transkriberende overflade, sikrer, at mRNA-molekyler oversættes parallelt med hinanden på en sådan måde, at de ikke laver knuder. Polycistroniske operoner sikrer, at proteiner med relaterede funktioner udtrykkes lokalt, hvilket tillader kanalisering af de tilsvarende vej mellemprodukter. På denne måde kobles strukturen af mRNA-molekyler til deres skæbne i cellen og til deres funktion i opdeling. Gener oversat sekventielt i operoner er fysiologisk og strukturelt forbundet. Dette gælder også for mRNA ‘ er, der oversættes parallelt med hinanden, hvilket antyder, at flere RNA-polymeraser er involveret i transkriptionsprocessen samtidigt, åget som trækdyr. Faktisk, hvis der er sammenhæng mellem funktion og/eller lokalisering i en dimension, eksisterer der en lignende begrænsning i de ortogonale retninger. Fordi ribosomer tiltrækker tRNA-molekyler, skaber de en lokal kobling mellem disse molekyler og kodonerne, der oversættes. Dette forudsiger, at et givet ribosome fortrinsvis ville oversætte mRNA ‘ er med lignende mønstre af kodonbrug. Som en konsekvens, når man bevæger sig væk fra et stærkt partisk ribosom, ville der være mindre og mindre tilgængelighed af de mest partiske tRNA ‘ er. Dette skaber et selektionstryk for en gradient af kodonbrug, da man går væk fra de mest partiske meddelelser og ribosomer, der nestede transkripter omkring central kerne(er), dannet af transkripter til stærkt partiske gener. Endelig skaber ribosomsyntese en frastødende kraft, der skubber DNA-tråde væk fra hinanden, især fra regioner nær replikationens oprindelse. Sammen resulterer disse processer i en gengradient langs kromosomet, hvilket er et vigtigt element i cellens arkitektur.